茶多酚對大鼠慢性缺氧損傷保護的實驗研究

摘要：大鼠在高原環境模擬艙內間斷缺氧及注射CoCl₂溶液以建立紅細胞增多癥模型，實驗分4組：平原組、慢性缺氧組、高劑量TP+慢性缺氧組、低劑量TP+慢性缺氧組，研究茶多酚對慢性缺氧誘導的大鼠紅細胞增多癥及心肌缺氧損傷的影響，結果顯示，茶多酚能夠顯著抑制缺氧大鼠的紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積的增加，降低骨髓增生程度，減小缺氧大鼠心室重量指數，增加缺氧大鼠Hermannnwillson指數，同時經茶多酚處理的缺氧大鼠心肌損傷程度較單純缺氧組輕，提示，茶多酚對大鼠紅細胞增多癥有一定的預防作用，同時茶多酚還能減輕慢性缺氧對大鼠的心肌損傷程度。

關鍵詞：茶多酚；缺氧；紅細胞增多癥；心肌損傷

中圖分類號：R364.4 文獻標識碼：A 文章編號：1007－7847(2007)03－0268－05

茶多酚(tea polyphenols，TP)是從茶葉中提取的多酚類物質，是茶葉的重要風味物質及生理活性成分，作為一種高效低毒的天然抗氧化劑，目前在食品工業中已得到廣泛應用，除抗氧化作用外，臨床及實驗研究還發現TP可有效降低高血壓、冠心病、惡性腫瘤、胃腸道疾病等多種患者血液的全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積等參數，改善血液流變及微循環，抑制患者血液高粘滯狀態，從而避免了疾病的惡性循環，慢性缺氧可致紅細胞增多癥，高原缺氧所致高原紅細胞增多癥是一種常見的慢性高原病，多種疾病如慢性阻塞性肺病以及某些先天性心臟病等均可因機體缺氧導致紅細胞增多癥的產生，紅細胞增多癥患者紅細胞過度增生，血液流變異常，血液具有濃、粘、聚的特點，此外，慢性缺氧和紅細胞增多癥還可引起全身多器官、組織損害，如心肌損傷，本研究運用低壓性缺氧復合CoCl₂復制大鼠紅細胞增多癥模型，探討茶多酚是否對缺氧引起的紅細胞增多癥和心肌損傷具有預防和保護作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體質量180～200g，SPF級，購于本校附屬大坪醫院動物所。

1．1．2 主要藥品

茶多酚(tea polyphenols，TP)：純度98％，其中兒茶素含量80％，表沒食子兒茶素沒食子酸脂(Epigaltocatechin gallate，EGCG)含量45％，購于浙江東方茶業科技有限公司。

1．1．3 器材

乙二胺四乙酸二鉀鹽(Ethylenediaminete-traacctic acid-djpotassium salt，EDTA-K₂)真空采血管為山東威高集團公司生產，全功能自動血流變儀為北京(普利生)LBY-N6B型，自動血細胞分析儀為日本Sysmex-21型。

1．2 方法

1．2．1 動物飼養

標準大鼠飼料，購于本校附屬大坪醫院動物所，自由進食、進水，尤其保證充足飲水。

1．2．2 實驗分組及給藥

50只大鼠用隨機排列表分成4組：對照組(平原組，海拔221m，n=8)、慢性缺氧組(n=14)、TP(20mg/kg.bw)+慢性缺氧組(高TP組，n=14)、TP(10ms/kg.bw)+慢性缺氧組(低TP組，n=14)，每兩天一次皮下注射TP，平原對照組和慢性缺氧組給等量消毒蒸餾水。

1．2．3 紅細胞增多癥動物模型復制

慢性缺氧組、高TP組、低TP組置于高原環境模擬艙中，5000m、12h/d，40d；每兩天一次腹腔注射CoCl₂溶液5.5mg/kg.bw(單日給CoCl₂，雙日給TP)，模型復制結束時，在模擬高原4000m的低壓氧艙內采取動脈血和取材。

1．2．4 取樣及紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積測定

20％烏來糖麻醉后，經頸動脈導管取血，ED-TA-K2抗凝，然后用三分類血液分析儀測定大鼠血中紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積等值，采取動脈血后，立即取心、骨髓等組織備用。

1．2．5 骨髓涂片制作

取大鼠股骨骨髓制作涂片，并進行瑞氏染色，骨髓增生分級標準見表1。

1．2．6 心肌肥大的判定指標

左心室重量指數(left ventricle weight index，LW)：(左心室重量+室間隔重量)／體重，右心室重量指數(right ventricle weight index，RW)=右心室重量／體重，Hermannwillson指數(Hermannwill-son index)=(左心室重量+室間隔重量)／右心室重量。

1．2．7 心肌病理切片制備

取右心室肌制作病理切片，HE染色，參照Rona等標準將心肌病理損傷分為4級，0°心肌無病變：肌纖維排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無細胞腫脹：I°心肌出現散在性點狀壞死伴炎性細胞浸潤，主要為凝固性壞死灶，局限于心內膜下；Ⅱ°心肌壞死灶呈片狀分布，灶間五連接，肌纖維腫脹和斷裂，病變累及心壁全層；Ⅲ°心肌廣泛性大片狀壞死，灶間相互連接累及心壁全層；Ⅳ°遍及整個心臟的融合性損傷，包括梗死樣的廣泛壞死，偶有急性動脈瘤或附壁血栓，按心肌病變級別對心肌損傷程度進行統計。

1．3 統計學處理實驗各組樣本數n≥7，數據以x±S表示，采用統計軟件SPSSl2.0進行方差分析，或計數資料采用非參數檢驗：nemenyi秩和檢驗。

2 結果

2．1 大鼠體征及癥狀

與正常組相比，各實驗組大鼠精神狀態較差，部分大鼠唇周、耳色黯紅，鼻、眼有出血現象，個別嚴重者畏寒少動、反應遲鈍、被毛蓬松無光澤，而這些情況在單純低壓缺氧組更為明顯。

2．2 紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積

觀察血液樣本，可見缺氧組大鼠血液呈暗紅色，非常濃粘，而TP組血樣則有明顯改善，測定結果見表2，結果顯示，缺氧使大鼠紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積值均顯著增加，TP則能夠顯著抑制缺氧大鼠的紅細胞數、血紅蛋白和紅細胞壓積的增加，且高劑量TP的作用大于低劑量TP。

2．3 骨髓增生情況

骨髓涂片顯示，慢性缺氧模型組全骨髓增生明顯或極度活躍，以紅系增生為主，大多有粒紅比下降，TP處理組骨髓增生程度均明顯降低，極度活躍骨髓相明顯下降，而增生活躍或明顯活躍的比例上升(P＜0.05)，但高TP組與低TP組間無顯著差異(P＞0.05)，見表3，說明TP可降低慢性缺氧大鼠的骨髓增生程度。

2．4 心肌重量指數

由表4可見，缺氧對照組和TP組大鼠LW和RW值均有增加，但TP組卻明顯低于缺氧對照組(P＜0.05)；低TP組RW值高于高TP組(P＜0.05)，而LW值無明顯差異；各實驗組Her-mannnwillson指數明顯降低，但TP組卻明顯高于缺氧對照組(P＜0.05)，慢性低壓缺氧加CoCl₂處理使大鼠左右心室均發生肥大，右心室肥大較左心室程度高，而TP可以減輕心室尤其是右心室的肥大程度。

2．5 心肌病理切片

對照組，心肌無病變；缺氧對照組，血管充 血，心肌纖維間有少量點狀出血，間質少量炎細 胞，心肌纖維間隙增寬，主要呈灶性或點狀心肌細胞變性溶解，有空泡變或波浪變，心肌損傷分級有Ⅰ°、Ⅱ°、Ⅲ°，以Ⅱ°為主，TP處理組的心肌損傷程度均較單純缺氧組輕(P＜0.05)，見表5和圖1、圖2。

3 討論

慢性缺氧導致紅細胞代償亢進而過度增生，血液粘滯度增高，同時缺氧時紅細胞變形性下降，使血液達到高凝狀態，反而加重組織器官郁血、缺氧，形成惡性循環，導致紅細胞增多癥的發生，COCl2可使組織細胞發生缺氧，而紅細胞代償性增加，本實驗參考姜平等人的方法，運用低壓艙模擬海拔5000m高度和注射CoCl₂溶液復制出紅細胞增多癥動物模型，同時用茶多酚(TP)對實驗組進行處理，結果顯示茶多酚可顯著降低實驗大鼠的紅細胞數、血紅蛋白值和血球壓積，同時可減小缺氧大鼠心室重量指數，增加缺氧大鼠Her-mannnwillson指數，以及減少心肌損傷程度，提示茶多酚有預防或抑制缺氧大鼠發生紅細胞增多癥的作用，以及對心肌缺氧損傷有保護作用。

一般認為，人類高原細胞增多癥的診斷標準是紅細胞大于6.5×10¹²、血紅蛋白大于200g/L、紅細胞壓積大于65％，但未見相應的大鼠紅細胞增多癥診斷標準報道，本課題造模大鼠紅細胞數為10.76±0.68，血紅蛋白224.4±13.9。紅細胞壓積0.733±042，顯著高于對照組，參考人類高原細胞增多癥的診斷標準，結合造模大鼠的臨床癥狀，我們認為本實驗的動物模型復制方法是可行的。

組織缺氧可通過激活黃嘌呤氧化酶系統使自由基增多，使體內脂質過氧化反應增加，自由基的增多使紅細胞結構和功能發生異常，膜流動性和變形能力降低，TP是含有兩個以上互不相鄰的羥基多元酚，是很好的供氫體，有很強的抗氧化作用，體外研究表明，TP對離體的紅細胞氧自由基損傷有顯著的抑制作用，可保護體外黃嘌呤氧化酶、過氧化氫和紫外線照射等自由基產生體系誘導的紅細胞膜脂質過氧化損傷，維持紅細胞膜的結構完整性和正常功能，人體研究也發現，TP能排除在高原產生的體內大量氧自由基，提高氧利用率。增強人體對高原的耐力，促進高原習服，TP可以降低血漿纖維蛋白原，穩定抗凝血酶Ⅲ活性，改善動脈內皮損傷，抗血小板凝聚，從而具有抗凝血、促纖溶作用，這可能也是缺氧大鼠的血液流變及微循環改善的重要原因之一，而血液流變及微循環的改善使組織供氧得到改善，本實驗發現TP可降低慢性缺氧大鼠的骨髓增生程度，導致紅細胞增生受到抑制，可能是紅細胞數量減少的重要原因，雖然紅細胞數量減少，但由于TP同時具有保護紅細胞結構和功能的作用，以及血液流變和微循環得到改善，因而氧的運輸和利用率得以提高，上述因素可能在TP抑制缺氧大鼠紅細胞增多癥的作用機制中有重要意義。

缺氧導致紅細胞生成素(ervthropoietin，E-PO)水平增高是高原紅細胞增多癥發病的關鍵因素之一，缺氧時EPO合成增加50～100倍，E-PO是紅細胞生成所必需的細胞因子，它通過紅細胞生成素受體依賴途徑，刺激紅系祖細胞有絲分裂，導致紅細胞大量產生，因此，EPO可能在TP對缺氧大鼠紅細胞增多癥的抑制作用中發揮重要作用，這也是我們將在下階段工作中探討的內容。

慢性缺氧引起肺動脈高壓是導致心臟肥大和心肌受損的主要環節，同時慢性低氧血癥引起心肌供血不足和紅細胞增多癥也是心肌損傷的主要因素，TP作為抗氧化劑，可通過清除自由基而減輕心肌細胞損傷，由于TP可抑制紅細胞增多癥的產生，血液粘度減低，可能通過緩解冠脈供血不足，使心肌肥大、梗死的程度減輕；同時，由于紅細胞容量減少使缺氧大鼠的總血容量減少，減少了心臟前負荷，可能也對心肌損傷有一定保護作用，有人發現TP可以通過上調心肌組織的Na-K-AT-Pase活性，改善心肌能量代謝，抑制心肌肥大損傷，因此，茶多酚可能主要通過抑制紅細胞增多癥和對心肌組織的直接保護作用，發揮其減輕缺氧大鼠心肌損傷的作用。

作者簡介：羅紅(1970－)，女，四川省大竹人，第三軍醫大學講師，博士研究生，主要從事高原營養學方面的研究。