人ｓＴＮＦＲ１基因的克隆以及在ＮＩＨ３Ｔ３細胞中的穩(wěn)定表達

摘 要：以Hela細胞的總RNA為模板，用RT－PcR方法擴增sTNFR1全編碼區(qū)基因片段，構建含有目的片段的T載體克隆及真核表達載體pcDNA3.1(一)重組質粒亞克隆，將重組質粒和脂質體共同轉染NIH3T3細胞系，G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株，經(jīng)核苷酸序列測序和酶切鑒定，成功構建了pcDNA3.1(－)－sTNFR1真核表達質粒，脂質體法建立了高效表達sTNFR1的穩(wěn)定轉染細胞系，并經(jīng)RT－PCR和Westem Blotting鑒定，人sTNFR1基因能在NIH3T3細胞系中穩(wěn)定表達，為今后的研究打下了基礎。

關鍵詞：人可溶性腫瘤病壞死因子受體1；克隆；真核表達；穩(wěn)定轉染

中圖分類號：R575.3

文獻標識碼：A

文章編號：1007－7847(2007)01－0078－06

腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor，TNFα)是體內重要的免疫調節(jié)因子和炎癥介質，它的生物學作用通過受體介導，TNFα過量表達與敗血癥休克、暴發(fā)性肝炎、類風濕性關節(jié)炎和移植后的排斥反應等疾病的發(fā)生有密切相關，而TNFα的可溶性受體(sTNFR1)可中和TNFα的毒性作用，因此sTNFR1有潛在的臨床應用價值，本文擬構建sTNFR1的真核表達載體，并在NIH3T3中表達，為下一步sTNFR1用于基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細胞株與質粒

JM109由我室保存，人Hela細胞株和小鼠成纖維細胞(NIH3T3)由中南大學腫瘤研究所提供，pGEM-T載體購自Promega公司，真核表達質粒pcDNA3.1(-)購自美國Invitrogen公司．

1.1.2 酶及主要試劑

TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、BamH I、EcoR I、DNA回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒購自TakaRa公司，MMLV逆轉錄酶購自Promega公司，脂質體轉染劑Lipofactamine 2000購自美國Invitrogen公司，TRIzol Reagent RNA分離液、DMEM(高糖)、新生牛血清和G418購自美國GIBCO BRL公司，兔抗人sTNFR1多克隆抗體購自PEPROTECH公司，Western-blotting檢測試劑盒購自博士德公司，ECL試劑盒購自Amersham公司，常用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 引物

GAPDH引物：購自北京鼎國生物公司，上游引物序列：5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′;下游引物序列：5′TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA 3′，目的片段452 bp，人sTNFR1擴增用PCR引物參照其cDNA^[7]設計，由上海博亞公司合成，上游引物：5′-GAA TCC ATG GAT AGT GTGTGT CCC C-3′;下游引物：5′-GTC GAC GGA TCCTCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，

1.1.4 儀器

核苷酸測序使用AB1377全自動測序儀及配套的BigDye Terminator試劑盒，由博亞公司完成，Tannon Gis凝膠分析系統(tǒng)為上海天能公司產(chǎn)品，

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴增sTNFR1目的片段

自Hela細胞中提取總RNA作為逆轉錄模板，采用RT-PCR方法擴增sTNFR1基因，逆轉錄反應條件參照MMLV逆轉酶說明書進行：取總RNA 3μg，Oligo(18)0.5μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至總體積12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP12.5nmol，RNA酶抑制劑25U，MMLV逆轉錄酶200U。加DEPC水至總體積25L，42cI=60min逆轉錄，逆轉錄后產(chǎn)物為cDNA，PCR反應體系為cDNA 2μL，TaqDNA聚合酶0.5U，10×Buffer(Mg²⁺)5μL，10mmol/L dNTP3 4μL，人sTNFRl引物各25pmol，加雙蒸水至總體積50μL.PCR條件：95℃5min預變性，94℃40s變性，55℃40s退火，72℃1min延伸，32個循環(huán)后，72℃延伸15 min．

1.2.2 構建T載體克隆

PCR產(chǎn)物用DNA回收純化試劑盒回收純化后與T載體連接，轉入感受態(tài)大腸桿菌JMl09，經(jīng)藍、白篩選，挑選單個陽性克隆，在含有100mg/L氨芐青霉素培養(yǎng)基中過夜生長，提取質粒，用BamH I和EcoR I雙酶切鑒定。

1.2.3 構建真核表達載體亞克隆

將T載體克隆酶切后目的片段，質粒pcDNA3．1(－)用BamH I、EcoR I雙酶切后經(jīng)大齒孔電泳，DNA回收純化試劑盒回收純化，將純化后的兩基因片段16℃過夜連接，轉入感受態(tài)細菌JMl09，挑取陽性克隆，接種于含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)過夜生長，提取質粒，BamHI和EcoR I雙酶切鑒定，并且核苷酸測序證實。

1.2.4 重組質粒轉染NIH3T3細胞及陽性細胞克隆的篩選

在6孔板中接種NIH3T3細胞(每毫升2×10⁵個細胞)，37℃、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，待細胞生長至90％－95％滿時分別用重組質粒(pcDNA3.1(－).sTNFRl)和空質粒(pcDNA3.1(－))進行轉染，并設陰性對照(僅有培基，不加質粒DNA)，具體操作按脂質體Lipofac－tamine 2000說明書進行，轉染后96h，改用選擇性培基(G418濃度前兩天為250mg/L，后為500mg/L)，隔日換液，一共選擇培養(yǎng)16d，至陰性對照孔細胞全部死亡，后降G418濃度為250mg/L，第18d后陸續(xù)挑取6個單克隆細胞(分別編號為N1－6)擴大培養(yǎng)．建立穩(wěn)定傳代的轉染細胞株pcDNA3.1(-)-sTNFR1/NIH3T3(PSR/NIH3T3)。

1.2.5 重組質粒轉染NIH3T3細胞及陽性細胞克隆的鑒定

1)對PSR/NIH3T3 6個細胞系進行RT-PCR分析，pcDNA3.1(－)/NIH3T3(P/NIH3T3)和NIH3T3作對照，篩選sTNFR1 mRNA有表達的真性克隆，細胞RNA的提取步驟同上，在紫外分光光度儀上檢測RNA的質量及濃度后進行RT-PCR，取總RNA3 μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至總體積12μL，70℃5min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP³ 12.5nmol，RNA酶抑制劑25U，MMLV逆轉錄酶200U，加DEPC水至總體積25μL，42℃60min逆轉錄；逆轉錄后產(chǎn)物為cDNA，取cDNA2μL，加入10×PCR Buffer 5μL，dNTP³ 20nmol，sTNFR1上游及下游引物各50pmol，GAPDH上游及下游引物各50pmol，TaqDNA聚合酶3U，加雙蒸水至總體積50μL。置PCR儀中，循環(huán)溫度及時間為：95℃5min；隨后以3步循環(huán)(94℃40s，55℃40s，72℃1min)擴增DNA，共32個循環(huán)；最后72℃10min延伸，反應結束后取PCR產(chǎn)物8μL，1.2％瓊脂糖凝膠電泳照相。

2)對RT-PCR鑒定的5個單克隆細胞株取其中1株作Western-blotting鑒定，并以P/NIH3T3和NIH3T3作對照：將100mL培養(yǎng)瓶中的細胞，用冰預冷PBS洗一次，加入1mL裂解緩沖液，冰浴20min，用細胞刮刮下細胞，將裂解緩沖液及細胞碎片吸入一預冷的EP管中；4℃下10000r/min，離心2min；將上清液吸人一新EP管，保存于－70℃二將蛋白與加樣緩沖液1:1比例混合，100℃煮沸5min；10000r/min離心5min；上清用于加樣。

將收集的上清液進行SDS-PAGE電泳分離后，將細胞蛋白轉移到PVDF膜上，100V、4℃轉移電泳70min，轉膜完畢經(jīng)麗春紅染色可見有目的蛋白條帶，TBS洗滌兩次，用含5％脫脂奶粉的TBST 37℃封閉1h，將PVDF膜與兔抗人sTNFR1多克隆抗體(濃度0.1mg/L)溫育2h，TBST洗滌5minx3后。與HRP標記的羊抗兔IgG(1:3000)室溫孵育1h，TBS洗滌10min×3，0.1mL/em²量加ECL發(fā)光試劑，暗室內曝光X光膠片，常規(guī)方法顯影、定影。

2 結果

2.1 sTNFR1基因片段的擴增及純化

經(jīng)擴增的sTNFR1的基因片段的產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳可見558bp大小的DNA條帶(圖1)。

2.2 T載體克隆的構建

將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接后轉入感受態(tài)大腸桿菌JM109，以對目的片段大量擴增，經(jīng)對陽性克隆質粒提取及酶切鑒定，證實成功構建T載體克隆(圖2)。

2.3 sTNFR1基因真核表達的亞克隆

將酶切、純化后的目的片段與表達載體pcD—NA3.1(-)連接，轉化入感受態(tài)細菌JM109，獲得含peDNA3.1(-)-sTNFR1重組表達質粒基因工程菌，并經(jīng)酶切(圖3)及核苷酸測序證實(圖4)。

2.4 sTNFR1的穩(wěn)定轉染細胞株的鑒定

1)RT-PCR檢測sTNFR1 mRNA的表達

擴增培養(yǎng)單克隆細胞，提取細胞總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外掃描兩種方法檢測示RNA抽提質量較好(圖5)，RT-PCR的結果表明PSR/NIH3T3、P/NIH3T3、NIH3T3細胞中均不同程度地擴增出sTNFR1的mRNA.經(jīng)擴增產(chǎn)物密度半定量檢測有5株PSR/NIH3T3的sTNFR1為高水平表達(表1、圖6)。

2)Western-blotting檢測sTNFR1高表達細胞株

PSR/NIH3T3單克隆株N1、P/NIH3T3細胞株和NIH3T3細胞株均在30kD處有sTNFR1蛋白表達，以β-actin為內參照，PSR/NIH3T3單克隆株N1蛋白質表達強度明顯高于P/NIH3T3細胞株和NIH3T3細胞株(圖7)，經(jīng)Western-blotting鑒定，PSR/NIH3T3單克隆株N1為穩(wěn)定轉染細胞株。

3 討論

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)是由激活的單核巨噬細胞分泌的，具有多種生物學效應的細胞因子，它的生物學功能是通過與細胞表面TNFα受體的結合來實現(xiàn)的，TNFα受體有兩種——TNFR1(55 kD)和TNFR2(75 kD)，均為糖蛋白，其中TNFR1介導了大部分TNFa的生物學功能，如抗病毒、誘導凋亡，活化NFKB，成纖維細胞增殖等，TNFR的兩種受體(TNFR1和TNFR2)均可分兩種類型，膜結合型(mTNFR)和可溶型(sTNFR)，可溶性受體為膜結合型受體胞外區(qū)在TNF轉換酶(TACE)的作用下從細胞膜上解離下來，游離在血液中，仍可與TNFa結合，但無法介導TNFa的信號傳導，因此，sTNFR能競爭性地與TNF分子結合，形成可溶性TNF-sTNFR復合物，間接抑制TNFa的生理作用，有研究表明，體內TNFα的過度表達在多種疾病的發(fā)生發(fā)展病理過程中發(fā)揮著重要作用，如：敗血癥休克、暴發(fā)性肝炎、類風濕性關節(jié)炎和移植后排斥反應等，因此，應用sTNFR1抑制TNFa的生理作用，以治療TNFa介導的疾病有著重要的意義，盡管sTNFR1屬內源性物質，但從體液中直接提取sTNFR1的量有限，難以滿足臨床治療與診斷的需要，利用基因工程的方法生產(chǎn)sTNFR1有深遠的研究和應用價值。

人sTNFR1是一種具有生物學活性的分泌性蛋白，國內高波等利用桿狀病毒穿梭載體Bacmid轉染sf21昆蟲細胞，獲得了高效表達，而我們將sTNFR1cDNA重組在真核表達載體pCDNA3.1(-)中，該載體在多克隆位點的上游及下游分別帶有CMV的啟動子和BGH的poly A尾，這種強有力的巨細胞病毒的增強啟動子序列，能高效表達插入的目的基因，并且可在廣泛的宿主細胞中工作，本研究從人Hela細胞提取總RNA，自行設計并合成sTNFR1兩條引物，通過RT-PCR獲得了的558bp大小的目的片段sTNFR1全編碼的基因，構建了重組質粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1亞克隆，經(jīng)酶切及和核苷酸測序，證實獲得pCDNA3.1(-).sTNFRl重組基因工程菌，將測序因子與Loetscher等報告的序列比較，結果完全一致，無移碼突變，sTNFR1真核表達載體的構建為下一步基因轉染，表達目的蛋白奠定了基礎。

NIH3T3為小鼠成纖維細胞株，來源于Swiss小鼠胚胎，早在1962年建系，本研究之所以選用NIH3T3作為基因轉導的載體細胞是因為成纖維細胞容易在體外培養(yǎng)及大量擴增，其回輸?shù)姆椒ㄒ布捌浜唵危趧游飳嶒炛校梢灾苯幼⑸淙胧荏w的腹腔或皮下，已有大量的將不同細胞因子基因轉入成纖維細胞的報道，這些細胞因子在成纖維細胞中均能穩(wěn)定的表達，在血友病的基因治療中，Roth等用電穿孔法將FⅧ因子基因導入甲型血友病患者離體成纖維細胞，篩選出能分泌FⅧ蛋白的成纖維細胞，克隆擴增后注入患者腹腔，6例接受治療的患者有4倍血漿FⅧ水平明顯增高，出血癥狀改善并持續(xù)10個月之久，成功地采用成纖維細胞作為基因治療的靶細胞用于治療血友病，故本研究選取NIH3T3細胞系作穩(wěn)定轉染。

本研究選用Invitrogen公司的陽離子脂質體Lipofectamine 2000，其轉染條件穩(wěn)定，轉染效率高．我們根據(jù)產(chǎn)品說明書確定脂質體懸液用量為10μL，DNA用量為4μg，選定6/h為脂質體－DNA復合物和細胞的孵育時間，成功地將重組質粒轉入NIH3T3細胞，并篩選出穩(wěn)定表達的PSR/NIH3T3細胞系，在鑒定PSR/NIH3T3的實驗過程中發(fā)現(xiàn)，不論是P/NIH3T3還是NIH3T3均有sTNFR1的表達，但PSR/NIH3T3細胞中的sTNFR1表達量，不論是mRNA水平還是蛋白表達水平均明顯高于P/NIH3T3和NIH3T3，說明轉入細胞內的基因能有效表達．PSR/NIH3T3穩(wěn)定轉染細胞系的建立為利用該細胞系進行基因治療的實驗研究打下了基礎。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。