白英提取物誘導乳腺癌ＭＣＦ－７細胞凋亡及其對凋亡相關基因表達的影響

【摘要】 目的 探討白英提取物(Solanum lyratum Thunb extract，STE)對乳腺癌MCF-7細胞凋亡及凋亡相關基因survivin和caspase-3表達的影響。方法 體外培養MCF-7細胞，以2.5、5、10 mg/L STE處理MCF-7細胞48小時，并以2.5 mg/L順鉑(DDP)作為陽性對照。用MTT法檢測細胞抑制率，TUNEL法檢測凋亡率，半定量RT-PCR檢測survivin和caspase-3 mRNA表達。結果 與正常對照組比較，STE各濃度組細胞抑制率顯著上升(P<0.001)，細胞凋亡率明顯升高(P<0.001)，caspase-3 mRNA表達顯著上升(P<0.001)，survivin mRNA表達明顯下降(P<0.05或P<0.01)。結論 STE具有誘導MCF-7細胞凋亡作用，其分子機制可能與上調caspase-3及下調survivin基因表達有關。

【關鍵詞】 白英；MCF-7細胞；細胞凋亡；survivin； caspase-3

文章編號：1003-1383(2007)04-0357-03

中圖分類號：R 737.9

文獻標識碼：A

Apoptosis-inducing Effect of Solanum lyratum Thunb Extract on Human Breast

Cancer MCF-7 Cells and the Expression of Apoptosis Associated Genes

WEI Xing，LI Chao-gan，NONG Song

(Department of Microbiology，Youjiang Medical College for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)

【Abstract】 Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Solanum lyratum Thunb extract(STE) and the expression of apoptosis associated genes survivin and caspase-3 on human breast cancer MCF-7 cells.Methods MCF-7cells were treated with 2.5，5 and 10 mg/L STE for 48 h， and the cells were treated with 2.5 mg/L DDP as positive control. The inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by TUNEL method. The expression of survivin and caspase-3 mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR.Results Compared with control group， the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001)， the apoptotic rate was increased markedly(P<0.001)， the expression of caspase-3 mRNA was increased significantly(P<0.001)， while survivin mRNA was decreased markedly (P<0.05 or P<0.01) in STE groups.Conclusion STE can induce MCF-7 cells apoptosis. The molecular mechanism might be related to up-regulating expression of caspase-3 and down-regulating expression of survivin genes.

【Key words】 Solanum lyratum Thunb； MCF-7 cells； apoptosis； survivin； caspase-3

白英(Solanum lyratum Thunb，ST)為茄科植物，又稱白毛藤，是常用的抗癌中草藥，在臨床上多用于治療肺癌、子宮頸癌、食道癌、乳腺癌和肝癌等多種癌癥^[1]。研究證實，ST提取液能通過上調fas基因和下調fasL基因表達，誘導Hela細胞凋亡^[2]。生存素(Survivin)是迄今發現最強的凋亡抑制因子，其主要通過抑制caspase級聯反應下游的caspase-3和caspase-7活性，從而抑制細胞凋亡^[3]。本研究通過觀察ST提取物(STE)誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡作用，并檢測凋亡相關基因survivin 和caspase-3 mRNA表達情況，以探討ST抗乳腺癌作用及其初步分子機制。

材料和方法

1.材料 乳腺癌MCF-7細胞株由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養基為GIBCO公司產品，四甲基偶氮唑藍(MTT)為上海普飛生物技術有限公司產品，原位細胞凋亡檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術公司產品，RT-PCR試劑盒為Promega公司產品，PCR引物為上海生物工程公司合成。KHB-Labsystems K₃酶標儀為芬蘭雷勃公司生產，BX51型顯微鏡為日本OLYMPUS公司生產，PCR儀為杭州郎基科學儀器有限公司生產。

2.方法

(1)藥物提取 取ST(購買于百色市中醫院中藥房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，溫度40℃，合并濾液，旋轉蒸發器干燥得ST浸膏，二甲基亞楓(DMSO)溶解浸膏樣品配制成濃度為10 mg/ml提取物藥液， 再以細胞培養液稀釋成所需濃度供實驗用。

(2)實驗分組和藥物處理 體外按常規培養乳腺癌MCF-7細胞生長至對數增殖期，隨機分為正常對照組(即不加藥物處理)、STE處理組(濃度分別為2.5、5、10 mg/L)和DDP組(濃度2.5 mg/L)；更換含0(正常對照組)、2.5、5、10 mg/L STE和2.5 mg/L DDP的新鮮培養液，藥物作用時間均為48 h。

(3)細胞增殖抑制試驗(MTT法) 將對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞移入96孔培養板中，細胞密度約為1×10⁴個/ml，每孔加入200 μl細胞懸液，培養24 h。吸棄孔內原培養液，加入含STE的10%胎牛血清RPMI 1640培養液200 μl，每個藥物濃度設4個平行復孔，另設DDP為陽性對照組和空白對照孔。培養到44 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h后終止，小心吸棄孔內上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震蕩混合儀震蕩10 min。選擇492 nm波長酶標儀測定每孔光吸收值(OD值)。實驗重復3次。按下公式計算抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

(4)TUNEL法檢測細胞凋亡 細胞凋亡檢測步驟按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。藥物作用后，收集各組細胞，用PBS漂洗兩遍后進行細胞涂片，風干后丙酮固定15 min；細胞在滲透液(0.2%Triton X-100，0.1%檸檬酸鈉)中孵育5 min，雙蒸水沖洗玻片；滴加TUNEL反應混合物，37℃濕盒中孵育30 min；滴加轉化劑-POD，37℃濕盒中孵育30 min，沖洗玻片；滴加DAB底物溶液，室溫5~10 min；蒸餾水沖洗，蘇木素復染、脫水、封片；以不加TUNEL反應混合液作為陰性對照。細胞核呈棕黃色為TUNEL反應陽性細胞(即凋亡細胞)。光鏡下分析結果，隨機計數10個高倍視野下陽性細胞所占百分數即為細胞凋亡率。

(5)半定量RT-PCR檢測基因mRNA表達 藥物處理細胞后，按Trizol試劑盒的說明書提取總RNA。Survivin，caspase-3和內對照β-actin引物借助primer premier 5.0軟件設計，并經Genebank驗證(見表1)。按試劑盒說明采用一步法進行RT-PCR。RT-PCR反應體系總體積50 μl，逆轉錄45℃×45 min，AMV RT滅活和預變性94℃×2 min，然后進行PCR 35個循環(94℃×30 s，57℃×1 min，68℃×2 min)，最后延伸68℃×7 min， 終止于4℃。各取PCR產物10 μl，加溴酚藍指示劑2 μl，于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳約1 h(電壓90伏)，用紫外透射分析儀觀察結果并拍照。通過密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以β-actin的表達量為對照計算并比較各組survivin和caspcse-3的相對表達量。實驗重復3次。

3.統計學處理 計量資料以均數±標準差(-±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。用SPSS11.5軟件進行統計學分析，P<0.05為有統計學差異。

結果

1.各組MCF-7細胞抑制率、凋亡率的比較 STE各濃度組及DDP組的細胞抑制率、凋亡率均顯著高于正常對照組(P<0.001)。表2。

2.各組MCF-7細胞基因表達比較 與正常對照組比較，STE各濃度組細胞survivin mRNA表達明顯下降(P<0.01或P<0.05)，caspase-3 mRNA的表達明顯上升(P<0.001)。見表3。

討論

本實驗發現STE對MCF-7細胞具有明顯的抑制增殖和誘導癌細胞凋亡的作用，并呈現一定的劑量依賴性(STE濃度與抑制率、凋亡率呈現正相關，兩者γ值分別為0.9831和0.9379)。提示一定濃度的STE對MCF-7細胞具有較強的殺傷能力并能誘導癌細胞凋亡，誘導細胞凋亡可能是其抑制MCF-7細胞生長的機制之一。

Survivin抗凋亡作用已被研究證實，它不僅通過阻斷線粒體細胞色素C釋放，與下游凋亡效應因子Caspase-3和Caspase-7結合而對其活性產生直接抑制效應，而且還通過與紡綞體纖維的結合，間接抑制Caspase對紡綞體的水解作用，有利于保護有絲分裂細胞的完整性，從而抑制細胞凋亡^[4]。另外，Survivin與細胞周期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)形成Survivin- CDK4復合體，釋放出P21，而P21能進一步與線粒體Caspase-3結合，抑制其活性，阻止細胞凋亡^[5]。本研究發現，STE能下調乳腺癌MCF-7細胞survivin mRNA表達，并呈現一定的劑量依賴性，提示STE誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡機制可能與下調survivin基因表達有關。

Caspase-3是Fas/Apo-1介導的凋亡信號轉導途徑的關鍵效應分子，又是多種凋亡途徑共同作用的因子，其表達水平的高低決定著細胞凋亡程度^[6]。本實驗結果證明，STE能使乳腺癌MCF-7細胞caspase-3 mRNA表達增高，提示其對MCF-7細胞凋亡的誘導可能是通過caspase-3激活而發揮作用。

綜上所述，我們認為STE誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡機制可能與上調caspase-3及下調survivin基因表達有關。但Survivin和caspase-3基因在STE誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡中的關系如何，其他基因是否參與等方面，尚待深入研究。

參考文獻

[1]吳婉瑩，高志剛，李云谷，等.白英和歐白英的化學成分與藥理活性[J].國外醫藥植物藥分冊，2001，16(6)：245-247.

[2]韋 星，李朝敢，農 嵩，等.白英提取液對Hela細胞凋亡及Fas/FasL基因表達的影響[J].中藥材，2006，29(11)：1203-1206.

[3]Lacasse EC，Baird S，Korneluk RG，et al.The inhibitors of apoptosis(IAps) and their emerging role in cancer[J].Oncogene， 1998，17(25)：3247-3259.

[4]Andrade F，Roy S，Nicholoson D.et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates：implication for CTL-induced apoptosis[J].Immunity，1998，8(4)：451-460.

[5]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10)：1346-1353.

[6]Tormanen，Napankangas U.Expression of Caspase-3，-6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma[J].International journal of cancer，2001，93(2)：192-198.

(收稿日期：2007-05-22 修回日期：2007-07-12)

(編輯：梁明佩 英文審校：唐雄林)

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