草莓基因工程研究進(jìn)展

摘 要：綜述了近20年來國(guó)內(nèi)外在草莓抗病蟲、耐鹽堿、抗凍、品質(zhì)特性、耐貯運(yùn)性、抗除草劑基因工程的研究概況與進(jìn)展，對(duì)當(dāng)前草莓基因工程育種工作中存在的問題進(jìn)行了探討，對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，指出了多基因轉(zhuǎn)化和利用轉(zhuǎn)錄因子、小RNA等調(diào)控基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化這2個(gè)發(fā)展方向并提出了把草莓作為果樹基因組學(xué)研究的模式植物之一的觀點(diǎn)。決定草莓品質(zhì)(風(fēng)味、香氣和顏色)的物質(zhì)多是萜類和黃酮類次生代謝物質(zhì)，這說明今后我國(guó)開展草莓次生代謝基因工程對(duì)其品質(zhì)改良的重要性。

關(guān)鍵詞：草莓；基因工程；多基因轉(zhuǎn)化；小RNA基因：次生代謝工程

中圖分類號(hào)：S668．4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2007)04-506-07

草莓(Fragaria×anannassa Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，同時(shí)亦是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的園藝作物。草莓的栽培品種和類型繁多，目前全世界有2000多個(gè)品種，已成為世界廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物之一。我國(guó)對(duì)草莓育種工作的研究起步較晚，過去草莓的改良多采用常規(guī)雜交技術(shù)，取得了一定的效果，產(chǎn)量和品質(zhì)得到了一定的提高和改善，但培育抗病菌、耐貯運(yùn)、抗除草劑、風(fēng)味好的草莓新品種，常規(guī)的育種手段仍然很難實(shí)現(xiàn)。當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的草莓栽培品種的遺傳背景狹窄，類型較單一，造成對(duì)病蟲害和逆境抗性的減弱。由于大多草莓具高雜合性和多倍性的特點(diǎn)，種間或種內(nèi)雜交難以獲得雜種。即使獲得雜種，種子往往敗育，生活力低，導(dǎo)致育種工作量大、效率較低。借助基因工程手段可以改良草莓品種，縮短育種周期，提高育種效率；通過轉(zhuǎn)入優(yōu)良植物源目的基因，可克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，實(shí)現(xiàn)草莓遺傳性狀的定向改良，提高育種效率，縮短育種年限；轉(zhuǎn)基因技術(shù)還可在分子水平上將微生物甚至動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移至草莓中，打破物種間的障礙，豐富性狀基因資源，擴(kuò)展遺傳改良范圍。自1988年Mc－Granahan等首次利用核桃體胚成功獲得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株以來，人們相繼在蘋果、草莓、桃、杏、香蕉、葡萄、樹莓、柑橘、櫻桃、獼猴桃等果樹上獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其中草莓是第3個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因植株的果樹。草莓是無性繁殖的，一旦目的基因如所期望在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)，就可以通過組織培養(yǎng)、匍匐莖等無性繁殖方式來大量擴(kuò)繁。可以說，基因工程為草莓育種開辟了新的途徑，有著重要的理論和實(shí)踐意義。近20年來，國(guó)內(nèi)外在草莓抗病蟲、耐鹽堿、抗凍、改善品質(zhì)、耐貯運(yùn)、抗除草劑等基因工程研究取得了一些進(jìn)展。本文簡(jiǎn)要綜述草莓基因工程的這些研究進(jìn)展，指出了當(dāng)前草莓基因工程育種工作中存在的問題和發(fā)展方向，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望，供我國(guó)進(jìn)一步開展草莓基因工程研究的科學(xué)工作者參考。

1 草莓基因工程研究進(jìn)展

草莓的基因工程遺傳轉(zhuǎn)化研究始于20世紀(jì)80年代末。隨著離體再生技術(shù)的日益成熟和克隆外源目的基因數(shù)量的增多，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來快速改良現(xiàn)有草莓品種就成為可能。1989年，Nehra等建立了草莓葉片直接高頻率誘導(dǎo)不定芽的再生體系。隨后，James等和Nehra等于1990年利用草莓的葉片或愈傷組織為材料，成功獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓基兇轉(zhuǎn)化植株。迄今，人們已將多種有價(jià)值的外源目的基因?qū)氲讲葺仓曛小?/p>

1．1 草莓抗病蟲基因工程

草莓抗病、抗蟲等生物逆境脅迫的基因工程主要包括抗病毒、真菌和害蟲這3個(gè)方面。在草莓產(chǎn)區(qū)．主要存在有草莓斑駁病毒(SMV)、草莓鑲脈病毒(SVBV)、草莓皺縮病毒(SCV)、草莓輕型黃邊病毒fSMYEV)這4種專一性病毒。他們?cè)谖覈?guó)草莓產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，可使草莓產(chǎn)量的損失超過30％。Tzane－takis等在草莓中首次發(fā)現(xiàn)了環(huán)斑病毒。目前通常采用昆蟲防治、切斷病毒傳播途徑或采用栽培脫毒苗等方式來減輕病毒對(duì)草莓的危害。利用基因工程技術(shù)，培育抗病毒的新品種，是解決草莓病毒危害的有效措施。抗病毒基因有外殼蛋白(CP)基因、復(fù)制酶基因、衛(wèi)星RNA、反義RNA等，其中比較成熟的途徑是利用病毒CP基因。Finsta等將草莓輕型黃邊伴隨病毒外殼蛋白導(dǎo)入到草莓中，獲得了病毒抗性較強(qiáng)的植株。草莓抗真菌基因主要有β-1，3-葡聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶抑制劑基因Cyf1等。Khan等發(fā)現(xiàn)編碼β-1，3-葡聚糖酶基因是一個(gè)多基因家族，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)β-1，3-葡聚糖酶在草莓葉片中表達(dá)。Shi等發(fā)現(xiàn)草莓β-1，3-葡聚糖酶基因FaBG2-3和FaBG2-1存在表達(dá)差別的現(xiàn)象，前者比后者至少高100倍。Mehli等發(fā)現(xiàn)草莓多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因受真菌的誘導(dǎo)。Martinelli等對(duì)利用基因工程技術(shù)來獲得抗真菌的草莓植株進(jìn)行了研究。Vellicce等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因ch5B的草莓對(duì)灰霉菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性，但炭疽病菌的抗性沒有增強(qiáng)。因此，有關(guān)草莓抗真菌病基因工程方面的研究有待于今后繼續(xù)深入。

抗蟲基因在草莓上的轉(zhuǎn)化研究主要集中在蛋白酶抑制劑(PI)和蘇云金殺蟲晶體蛋白(ICPs)的基因上。Graham等將豇豆蛋白酶抑制劑(CpTI)基因?qū)氩葺校晒Φ孬@得了轉(zhuǎn)基因植株。

1．2 草莓抗低溫和耐鹽堿的基因工程

草莓與低溫和鹽堿等非生物逆境脅迫有關(guān)的基因主要有磷酸酯酶基因、蛋白激酶基因、14-3-3蛋白基因、脫水基因、胚胎晚期豐富蛋白基因和一些轉(zhuǎn)錄因子。Houde等人將小麥酸性脫水基因Wcor410導(dǎo)入到草莓中，發(fā)現(xiàn)Wcor410可以阻止草莓膜的損傷，提高葉片的冷凍耐受能力，使得經(jīng)過寒冷馴化的轉(zhuǎn)基因草莓的冷凍耐受能力提高了5℃。Owens等將從草莓中分離出的轉(zhuǎn)錄因子CBFl基因?qū)氩葺@得了抗冷性提高的轉(zhuǎn)基因植株。與對(duì)照比，轉(zhuǎn)CBFl基因的草莓在田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凍能力。劉鳳華等將甜菜堿脫氫酶(BADH)基因?qū)氩葺ㄟ^促進(jìn)甜菜堿或山梨醇的積累，獲得了抗鹽的轉(zhuǎn)基因煙草和草莓植株。王俊麗等利用基因槍法將來自大麥的胚胎晚期豐富蛋白基因LEA導(dǎo)入草莓品種“達(dá)賽萊克特”的花藥愈傷細(xì)胞中，經(jīng)過除草劑的篩選，獲得了抗性愈傷組織和再生植株，為今后鹽分脅迫試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1．3 草莓品質(zhì)基因工程

草莓育種中，品質(zhì)是最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。草莓品質(zhì)包括果實(shí)的大小、風(fēng)味、甜酸度、維生素C含量、香氣和色澤等內(nèi)容。目前我國(guó)草莓的一些主栽品種存在果實(shí)含糖量較低、風(fēng)味不夠濃、氣味不夠芳香的缺點(diǎn)。克隆控制果實(shí)品質(zhì)的基因并進(jìn)行有效調(diào)控是草莓分子育種的重要內(nèi)容。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在提高草莓品質(zhì)基因工程方面做了不少工作。果實(shí)的大小與果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。與草莓果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的基因主要有生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因、生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因、鈣依賴蛋白激酶和FaGAST基因等。de 1a Fuente等發(fā)現(xiàn)草莓FaGAST基因可以通過抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)因子來影響草莓細(xì)胞的生長(zhǎng)，使植株生長(zhǎng)變慢、果實(shí)變小。Mezzetti等利用DefH9-i-aaM基因獲得了單性結(jié)實(shí)的草莓轉(zhuǎn)基因植株，他們發(fā)現(xiàn)DefH9-iaaM基因可以通過增加植株的花序數(shù)量，花序中果的數(shù)量和果實(shí)重量的方式使野生草莓、栽培草莓的產(chǎn)量得到提高，而且產(chǎn)量的增加并不會(huì)使果實(shí)的糖含量減少。Wawrzynczak等利用玉米生長(zhǎng)素葡萄糖合成酶基因?qū)Σ葺M(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，旨在研究該基因?qū)Σ葺胚嵋宜岽x以及生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

果實(shí)風(fēng)味與成熟度有很大的關(guān)系。與草莓成熟有關(guān)的基因主要有肉桂酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因、胞質(zhì)醛縮酶基因、內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶基因、HyPRP基因、脂肪加氧酶基因。Wilkinson等利用PCR差異顯示技術(shù)(PCR differential display)檢測(cè)到3個(gè)與草莓成熟相關(guān)的mRNA。

Bachelier等利用來自馬鈴薯的蔗糖酶基因?qū)Σ葺M(jìn)行了轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)該基因能調(diào)控蔗糖的降解。Dolgov等用含超甜蛋白ThaumatinⅡ的編碼區(qū)的雙元載體轉(zhuǎn)化草莓，并在草莓植株中成功的檢測(cè)到該基因的表達(dá)。Toldio等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)6-磷酸果糖-2-激酶／果糖-2，6-二磷酸酶(6PF2K／F2，6P2ase)的草莓植株中，2，6-二磷酸果糖含量高時(shí)有利于同化物向淀粉合成方向分配，反之則有利于蔗糖合成，且發(fā)現(xiàn)在蔗糖過量合成的植株中，氨基酸含量有所增加。Iannetta等分別從草莓未成熟和成熟果實(shí)的細(xì)胞壁中抽提出7種鹽溶性蛋白，并克隆了其中線粒體蘋果酸脫氫酶和線粒體檸檬酸合成酶的cDNA，分析后認(rèn)為線粒體蘋果酸脫氫酶和線粒體檸檬酸合成酶很可能是調(diào)節(jié)果實(shí)風(fēng)味和糖／酸平衡中的決定因子。控制草莓維生素C含量的為D-半乳糖醛酸還原酶基因GalUR，將該基因轉(zhuǎn)入煙草后，使煙草中維生素C含量提高了2-3倍。

控制草莓香氣的基因主要有0-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因SAAT、烯酮氧化還原酶基因FaQR、橙花叔醇合成酶和蒎烯羥基化酶基因。0-甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)草莓香草醛和2．

甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮(DMMF)的合成，SAAT負(fù)責(zé)揮發(fā)性酯類生物合成的最后步驟，F(xiàn)aQR蛋白含322個(gè)氨基酸，負(fù)責(zé)4-羥基-2，5-甲基-3(2H)呋喃酮(HDMF)的合成。Beekwilder等將草莓SAAT基因轉(zhuǎn)入矮牽牛后，能夠檢測(cè)SAAT蛋白的活性，但揮發(fā)性物質(zhì)沒有變化，喂飼異戊醇后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株可以釋放出乙酰基酯類。Lunkenbein等發(fā)現(xiàn)在反義0-甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)基因草莓中DMMF幾乎徹底喪失，阿魏酰1-O-β-D-葡萄糖與咖啡酰基1-O-β-D-葡萄糖的比例發(fā)生改變，而其它的揮發(fā)性物質(zhì)不受影響。

控制草莓色澤的基因主要有查耳酮合成酶(CHS)基因和二氫黃酮醇4-還原酶基因。二氫黃酮醇4-還原酶負(fù)責(zé)草莓花青素的合成。Lunkenbein等研究了草莓中穩(wěn)定態(tài)反義查耳酮合成酶基因表現(xiàn)型，發(fā)現(xiàn)查耳酮合成酶基因的表達(dá)被抑制后類黃酮生物合成途徑中的前體轉(zhuǎn)向苯丙烷類途徑，看來CHS基因是類黃酮生物合成途徑和苯丙烷類途徑之間底物流向的一個(gè)重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。

1．4 草莓耐貯運(yùn)性基因工程

草莓育種中，果實(shí)耐貯運(yùn)性也是重要的經(jīng)濟(jì)性狀。貯運(yùn)性主要與硬度的高低和褐變的快慢有關(guān)。草莓果實(shí)成熟后迅速變軟和褐化，導(dǎo)致果實(shí)不耐貯藏、運(yùn)輸，果汁易褐化，栽培草莓的效益大為降低。克隆控制果實(shí)成熟軟化、褐化等性狀相關(guān)的基因并進(jìn)行有效地調(diào)控是草莓分子育種的重要研究?jī)?nèi)容。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在改善草莓的耐貯運(yùn)性方面也做了許多工作。

控制草莓果實(shí)硬度和成熟軟化的基因主要有β-半乳糖苷酶、果膠酸裂解酶、果膠酯酶、伸展蛋白基因、β-木糖苷酶、內(nèi)-β-1.4-葡聚糖酶基因等。Medina-Escobar等從草莓中克隆了成熟相關(guān)基因njjs4的cDNA，該基因與高等植物Ⅰ型低分子量熱休克蛋白基因有同源性。Woolley等發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)反義內(nèi)-β-1.4-葡聚糖酶(endo-beta-1，4-glu-canase，EG)基因cel1的草莓果實(shí)中，cel1的mRNA降低很多，但EG酶的活性和果實(shí)硬度與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照相比沒有什么區(qū)別。轉(zhuǎn)反義cel1基因的植株中，另1個(gè)編碼內(nèi)-β-1.4-葡聚糖酶(EG)的基因cel2發(fā)生表達(dá)，使得cel1在果實(shí)軟化中所起的作用不易被揭示。Spolaore等以草莓果實(shí)為材料，分離了2個(gè)編碼內(nèi)-β-1.4-葡聚糖酶的基因FaEGl和FaEG3。對(duì)這2個(gè)基因的檢測(cè)表明，F(xiàn)aEG3 mRNA的水平低于FaEGl mRNA。Salentijn等利用含1701cDNA克隆的DNA芯片對(duì)2種不同的硬度的栽培草莓的基因表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)61個(gè)差異表達(dá)的克隆，其中有10個(gè)克隆與細(xì)胞壁相關(guān)基因同源。有意思的是，羥基肉桂酰輔酶A還原酶fCCR)和羥基肉桂醇脫氫酶(CAD)這2個(gè)與木質(zhì)素合成有關(guān)基因的表達(dá)差異最大。王關(guān)林等克隆了草莓膜聯(lián)蛋白(annexin)基因全序列的cDNA，并且將其基因命名為annfaf。那杰等司對(duì)草莓a(chǎn)nnfaf基因反義融合載體進(jìn)行構(gòu)建并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。Bustamante等從草莓cDNA文庫(kù)中獲得了編碼β-木糖苷酶(FaXyll)的全長(zhǎng)基因，他們發(fā)現(xiàn)FaXyll的mRNA在最軟的豐香品種中，果實(shí)成熟時(shí)很早就積累，而且其蛋白水平也很高，由此推測(cè)β-木糖苷酶(FaXyll)很可能與草莓果實(shí)的軟化有關(guān)。Jimenez-Bermudez等在41個(gè)轉(zhuǎn)反義果膠裂解酶基因的草莓株系(Apel lines)中，發(fā)現(xiàn)有33個(gè)株系的產(chǎn)量明顯降低。在完熟期，轉(zhuǎn)反義果膠裂解酶基因的果實(shí)在顏色、大小、形狀和質(zhì)量方面與對(duì)照沒有差別。大多數(shù)轉(zhuǎn)反義果膠裂解酶基因的成熟果實(shí)中離子結(jié)合果膠的含量比對(duì)照的成熟果實(shí)中低，其果實(shí)也要比對(duì)照硬。轉(zhuǎn)基因果實(shí)中果膠裂解酶基因的表達(dá)水平要比對(duì)照至少低30％，有3株甚至降為0。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因果實(shí)青、白和紅3個(gè)發(fā)育階段的分析，發(fā)現(xiàn)由白到紅這一階段，果實(shí)軟化程度降低最多，而且轉(zhuǎn)基因果實(shí)采后變軟的現(xiàn)象也消失。因此，果膠裂解酶基因是分子改良果實(shí)硬度、阻止果實(shí)軟化的優(yōu)秀候選基因。

1．5 草莓抗除草劑基因工程

雜草是草莓在栽培中面臨的一大難題。于冬梅等已將抗草丁膦的bar基因轉(zhuǎn)入草莓栽培品種“索菲亞”中，轉(zhuǎn)基因植株在離體培養(yǎng)和田間栽培試驗(yàn)條件下，均對(duì)PPT表現(xiàn)出良好的抗性。張志宏等建立了草莓高效、穩(wěn)定的離體再生和轉(zhuǎn)化體系，并進(jìn)行了GUS基因和bar基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將bar基因?qū)搿案ゼ醽啞辈葺贩N中后，轉(zhuǎn)bar基因的植株在附加除草劑草丁膦的培養(yǎng)基上能夠正常分化，轉(zhuǎn)基因植株在田間開花、結(jié)果正常，對(duì)草丁膦表現(xiàn)出強(qiáng)烈抗性，獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植株。

2 問題與展望

基因工程技術(shù)給草莓育種帶來了巨大的變革，但當(dāng)前草莓基因工程育種工作中也還存在一些問題：首先，安全問題已經(jīng)成為人們普遍關(guān)注的社會(huì)問題。草莓作為一種果品，外源基因的導(dǎo)入及其產(chǎn)物的表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生安全性問題。通過對(duì)外源基因表達(dá)的檢測(cè)、無標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用及其田間試驗(yàn)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)有望解決這個(gè)問題。其次，目前的草莓遺傳轉(zhuǎn)化效率不高，因此仍需進(jìn)一步優(yōu)化草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高效率。再次，基因工程可以培育出抗病毒、耐貯運(yùn)、抗除草劑的草莓新品種，但集這些優(yōu)點(diǎn)于一體的品種還很少，多基因轉(zhuǎn)化是今后一個(gè)值得嘗試的方向。

迄今，草莓的基因工程大多是單個(gè)結(jié)構(gòu)基因的操作，利用調(diào)控基因的例子還不多。轉(zhuǎn)錄因子是重要的調(diào)節(jié)因子。筆者認(rèn)為除了應(yīng)繼續(xù)關(guān)注CBFl和LEA等轉(zhuǎn)錄因子外，還應(yīng)關(guān)注另外一種重要的調(diào)控因子一小RNA(microRNA，miRNA)。小RNA是1種內(nèi)生的、長(zhǎng)度為21～22 nt、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA，由具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70～90個(gè)堿基的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成5′端具磷酸基和3′端具羥基。自1993年在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)第1個(gè)miRNA lin-4以來，研究人員在水稻、擬南芥、線蟲、果蠅、家鼠、人和病毒中發(fā)現(xiàn)了很多miRNA。迄今miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA數(shù)量已達(dá)4274個(gè)，其中植物的miRNA有916個(gè)。大量的研究結(jié)果表明。miRNA代表了新層次上的生物基因表達(dá)調(diào)控方式，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種重要策略。筆者已經(jīng)預(yù)測(cè)到了一些與草莓結(jié)構(gòu)基因(如控制果實(shí)褐化的多酚氧化酶基因等)起相互作用的小RNA分子。可以預(yù)計(jì)，利用小RNA等調(diào)控基因?qū)Σ葺M(jìn)行轉(zhuǎn)化將有望得到很好的結(jié)果。

由于草莓結(jié)果周期短，容易進(jìn)行遺傳操作，所以草莓應(yīng)該可以作為果樹作物基因組學(xué)研究的一個(gè)模式植物。眾所周知，決定草莓品質(zhì)(風(fēng)味、香氣和顏色)的物質(zhì)多是萜類和黃酮類次生代謝物質(zhì)，所以，今后我國(guó)開展草莓次生代謝基因工程對(duì)其品質(zhì)改良也將具有十分重要的意義。

我國(guó)在草莓單倍體培育及離體培養(yǎng)植株的再生的研究中占有一席之地，但在草莓優(yōu)良目的基因克隆和調(diào)控方面與國(guó)際同行相比還有一定差距。因此，我國(guó)草莓基因工程育種的研究需要更多的人力、物力和財(cái)力的投入，受到更多的重視，以便為我國(guó)草莓業(yè)的快速、穩(wěn)定發(fā)展提供更好的技術(shù)支撐和物質(zhì)保障。