血府逐瘀湯動員大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的實驗研究

摘要：目的觀察血府逐瘀湯動員大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞遷移，參與血管新生的作用。方法SD大鼠隨機分為生理鹽水組(對照組)及血府逐瘀湯高、中、低劑量組，灌胃給藥8 d后，腹主動脈采血，分離含內(nèi)皮祖細胞的單核細胞，進行細胞計數(shù)；血清中一氧化氮(NO)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量檢測以及流式細胞儀分析細胞表型和細胞周期。結(jié)果：雖然各組大鼠骨髓單核細胞數(shù)量、增殖能力以及VEGF受體(VEGFR)的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；但藥物促進NO的合成和分泌，對VEGF的影響作用正好相反，尤其中、高劑量組影響顯著(P＜0.05)；且中劑量組能明顯增加CD31的表達為25.20％±0.94％(P＜0.05)。結(jié)論：血府逐瘀湯通過NO途徑動員骨髓中內(nèi)皮祖細胞釋放，參與血管新生，說明藥物能動員骨髓中內(nèi)皮祖細胞遷移至外周血中，提高循環(huán)血中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量。

關(guān)鍵詞：血府逐瘀湯；骨髓；內(nèi)皮祖細胞

中圖分類號：R392.5 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0829－03

自從1997年Asahara等從外周血中分離出一類能分化成為內(nèi)皮細胞，參與血管形成的單核細胞，并將之命名為內(nèi)皮祖細胞(endothehal progenitor cells，EPC)以來，有關(guān)EPC與血管新生的關(guān)系日益受到重視。在動物缺血模型，外源性細胞因子以及藥物的刺激下，骨髓中的EPC司以被動員進入外周循環(huán)，定向遷移到血管再生區(qū)，直接參與血管損傷后的修復(fù)和血管新生過程，在治療性血管新生方面具有重要的科研價值和良好的臨床應(yīng)用前景。為了探討血府逐瘀湯在動員骨髓內(nèi)皮祖細胞方面的作用，開展了一些相關(guān)研究，并得到一些初步的結(jié)果，現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物及分組SD大鼠，(4～5)周齡，體重(100±10)g，雌雄不限，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物批號No 0024493。隨機分成生理鹽水組(對照組)和血府逐瘀湯高、中、低劑量組，每組6只。

1．2 藥物血府逐瘀湯組方：當歸9 g，生地9 g，桃仁12 g，紅花9g，枳殼60，赤芍6g，柴胡3g，甘草60，桔梗4.5g，川芎4.5 g，牛膝9 g。購自福建中醫(yī)研究院。該方水煎兩次，煎渡過濾，混合后加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 儀器及試劑

1．3．1 儀器倒置式系統(tǒng)顯微鏡IX70(OLYMPUS公司)，流式細胞儀FACS Cahbur(BD公司)，溶紅細胞處理儀(BD公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)。

1．3．2 試劑DMEM培養(yǎng)液、大鼠淋巴細胞分離液(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)、FITC標記的小鼠抗大鼠CD31(Serotec公司)、陰性對照小鼠IgG1－FITC(Serotec公司)、小鼠VEGFR2單克隆抗體(Abcam公司)、FITC標記的羊抗鼠IgG(BD公司)、CycleTEST^TM plus DNAREAGENT KIT(BD公司)、一氧化氮(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot20070324)和大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酶聯(lián)檢測試劑盒(晶美生物公司，Lot 20061120)

1．4 實驗方法

1．4．1 給藥方法大鼠按體重常規(guī)灌胃給藥，血府逐瘀湯高、中、低劑量組分別給予藥物9.100 g/kg、4.550g/kg(相當于人『臨床日用量的7倍)、2.275 g/kg，對照組用等量的生理鹽水，每天2次，共7 d。

1．4．2 大鼠外周血中內(nèi)皮祖細胞的分離第8天在給藥后2 h內(nèi)，采用氯胺酮麻醉大鼠，腹主動脈抽血，肝素抗凝。經(jīng)DMEM培養(yǎng)液等比稀釋后，用密度為1.082 g/mL的大鼠淋巴細胞分離液，1.200 r/min離心20 min分離單核細胞(MNC)，經(jīng)洗滌、離心形成細胞沉淀后，重新制備細胞懸液備用。

1．4．3 內(nèi)皮祖細胞表型CD31和VEGF受體(VEGFR)的檢測

吸取100μL細胞懸液(細胞濃度≥1×10⁶/mL)，加人10μLFITC標記的小鼠抗大鼠CD31抗體，同時做陰性對照，室溫避光孵育20 min，溶紅細胞處理儀機洗后，重新懸浮，上機檢測血小板內(nèi)皮細胞黏附分子－1(CD31)。VEGFR的檢測采用二抗標記進行。

1．4．4 DNA周期檢測采用流式細胞儀進行，具體操作步驟參見試劑盒使用說明書。利用cell Quest軟件獲取數(shù)據(jù)，ModiFit分析。

1．4．5 血清NO含量檢測采用硝基還原酶法進行，具體操作步驟參見試劑盒使用說明書。

1．4．6 血清VEGF含量檢測采用酶聯(lián)免疫法進行，具體操作步驟參見試劑盒使用說明書。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行組間檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 血府逐瘀湯對外周血中單核細胞數(shù)量和增殖能力的影響

不同劑量藥物組與對照組的單核細胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，且流式細胞儀的DNA周期分析表明，各組間處于二倍體DNA合成期的細胞很少，細胞相對靜止，增殖能力沒有顯著差別。

2．2 血府逐瘀湯對CD31和VEGFR表達的影響雖然各組間VEGFR的表達沒有明顯差異，但中劑量組CD31的表達顯著升高(P＜0.05)，說明藥物能使外周血中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量增加。

2．3 血府逐瘀湯對VEGF，NO合成和分泌的影響隨著藥物濃度的提高，血清中NO的濃度相應(yīng)升高，呈明顯的量效關(guān)系，其中中、高劑量藥物組血清中NO的濃度與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明藥物具有升高血清中NO濃度的作用。血府逐瘀湯對大鼠血清VEGF的合成和分泌的影響正好與對NO的影響相反，中、高劑量藥物組血清中VEGF的濃度與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明藥物抑制VEGF的合成和分泌。

3 討 論

血府逐瘀湯出自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》，原為治療胸中血府血瘀癥而設(shè)，其選藥精當，組方嚴密，是目前臨床常用的、經(jīng)典的活血化瘀方劑之一。以往研究工作對其生新方面的機制探討甚少。在以雞胚絨毛尿囊膜作為模型的篩選實驗中，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯具有顯著的促進血管新生的作用。由于內(nèi)皮祖細胞與血管新生直接相關(guān)，本實驗從血府逐瘀湯動員骨髓內(nèi)皮祖細胞參與血管新生的角度，探討該方劑生新的機制。

血管新生能力與產(chǎn)生NO能力之間呈很強的相關(guān)性。NO在動員骨髓中的EPC釋放進入外周血，提高循環(huán)血中EPC數(shù)量這個過程中起到至關(guān)重要的作用。骨髓中早期內(nèi)皮祖細胞被動員進入外周血后，伴隨著血循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞的分化，會發(fā)生表型的變化，逐漸表達出包括CD31等內(nèi)皮細胞系的典型標志，而且在分化成熟的細胞中，VEGFR的表達增強，出現(xiàn)高表達的特點。本實驗結(jié)果表明中、高劑量的血府逐瘀湯有明顯升高血清中NO濃度的作用，提示該藥物通過NO途徑在動員骨髓促血管新生中發(fā)揮作用。另外，中劑量藥物可使外周血中細胞表型CD31的表達顯著提高，符合內(nèi)皮祖細胞被動員的特征變化，進一步證實了藥物具有動員骨髓內(nèi)皮祖細胞遷移，進而促血管新生的作用。

在眾多的促血管生長因子中，VEGF與內(nèi)皮祖細胞的關(guān)系最為密切。VEGF作為血管發(fā)生的一個中樞調(diào)節(jié)因子，通過VEGF受體－2(VEGFR－2)對EPC的分化、成熟及血管形成起著至關(guān)重要的作用。但本實驗中血府逐瘀湯抑制VEGF的合成和分泌，且VEGFR的表達沒有變化，這可能與藥物能顯著提高NO的表達有關(guān)。NO作為細胞內(nèi)和細胞間的信號分子，具有廣泛的生物效應(yīng)，NO在血管新生中的作用是雙向性的，在動物實驗中可表現(xiàn)出矛盾的效應(yīng)，對于VEGF基因表達可以呈抑制作用，也可以呈刺激作用，取決于細胞的類型和環(huán)境，并與組織、細胞對缺氧的適應(yīng)程度有關(guān)。本實驗采用的動物為正常幼年大鼠，不存在病理上的缺血和缺氧現(xiàn)象，這是否導(dǎo)致藥物升高NO但抑制VEGF的表達，還有待進一步的實驗證實。

本文編輯 王雅潔