芪丹通脈片對缺血再灌注大鼠心肌損傷的保護作用

摘要：目的 觀察芪丹通脈片預處理對缺血再灌注大鼠心肌細胞損傷的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為4組，即假手術組(A組)、缺血再灌注模型組(B組)、芪丹通脈片加缺血再灌注Ⅰ組(C組)、芪丹逼脈片加缺血再灌注Ⅱ組(D組)。大鼠麻醉開胸，結扎冠狀動脈前降支40min，再灌注4h。采用Evan’sBlue和TTC染色測定心肌梗死范圍，井TUNEL法測定大鼠心肌組織的細胞凋亡，檢測血清中肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白Ⅰ(cTn I)的水平。結果不同劑量(1.08 g／kg，3.24 g／kg)芪丹通脈片預處理組，缺血／再灌注后心肌梗死面積和凋亡指數顯著小于模型組(P＜0.05或P＜0.01)；與假手術組比較，缺血／再灌注4h后B組大鼠血清CK和cTnⅠ有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)；而不同劑量芪丹通脈片預處理組再灌注后血青CK和cTnⅠ含量明顯降低，與B組比較有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。結論：芪丹通脈片預處理能夠有效地抑制缺血／再灌注所致大鼠心肌損傷。

關鍵詞：芪開通豚片，再灌汪損傷；心肌；細胞凋亡；大鼠

中圖分類號：R542.2 R285.6 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0821－03

急性心肌梗死后應用溶栓術、經皮冠狀動脈血管成形術等方法快速恢復冠狀動脈血流的再灌注策略對于挽救可用性心肌是必要的。然而，再灌注可引起心肌損傷加重，心肌細胞的進一步丟失和功能恢復障礙，缺血／再灌注損傷(ischemm repet-fusion injury，I／IR)是醫(yī)學面臨的新臨床問題。細胞凋亡是再灌注中心肌細胞丟失、心功能恢復障礙的病理機制之一。抑制細胞凋亡被證明能夠有效抑制再灌注損傷的重要策略。益氣活血復方芪丹通脈片具有益氣活血、化瘀通脈的功效(專利號：2006100419006)，用于防治缺血性心臟病能夠保護心肌。但其對于缺血／再灌注心肌損傷的影響還不清楚。本研究制備了缺血/在灌注大鼠心肌損傷模型，觀察不同劑量的芪丹通脈片對缺血／再灌注心肌梗死范圍、心肌細胞凋亡以及血清中心肌損傷標志物的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠24只，260 g±20 g，第四軍醫(yī)大學動物中心提供，合格證號：200505。

1．2 藥品和主要試劑：芪丹通脈片(Qiantongmai tablet，QDTMT)提取浸膏干粉(黃芪30 g，丹參30 g，當歸15 g，紅花30 g，桂枝10 g。每克干粉含生藥2.862 g。以生理鹽水配制成混懸液324 g／L，第四軍醫(yī)大學科研藥廠提供)，TUNEL試劑盒為Roche公司產品。

1．3 實驗方案 將大鼠隨機分為4組，每組6只，假手術組(A組)，動物開胸，冠狀動脈下穿線但不結扎；缺血再灌注模型組(MI／R，B組)；芪丹通脈片處理加缺血再灌注Ⅰ組(QDTMT－I，C組)；芪丹通脈片處理加缺血再灌注Ⅱ組(QDTMT－Ⅱ，D組)。

A組和B組給予生理鹽水10 mL／(kg·d)灌胃，C組和D組分別給予浸膏混懸液1 08 g／kg和3.24 g／kg灌胃10 mL(kg·d)均連續(xù)灌胃6 d。第7天，灌胃完成30min后進行造模。

1．4 心肌缺血再灌注模型制備

1．5 心肌梗死范圍的測定 實驗結束時，重新結扎包繞在冠狀動脈左降支的絲線，經頸動脈快速注入10 g／Evan’s蘭(2mL)染色區(qū)分缺血區(qū)(area at risk，AR)和非缺血區(qū)(顯示為藍色)。通過Optimax圖像處理軟件進行分析，并計算梗死面積(infaictsize)與缺血區(qū)面積(meaatrisk，AAR)的比值(％，IS／AAR)。

1．6 TUNEL法測定心肌細胞凋亡應用TUNEL凋亡檢測試劑盒嚴格按照原位細胞凋亡檢測試劑盒(POD)說明書進行操作。檢測前對石蠟切片進行微波修復。以標記前用DNA酶處理切片做陽性對照；在染色過程中用PBS代替TdT反應液，其余同說明書操作，作為陰性對照。

1．7 肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的測定實驗結束時由頸動脈采血，室溫靜置30 min，3000i/min離心15 min，取上清，－20℃存放待測。采用微粒子化學發(fā)光法由BeckmanCouker AccessⅡ全自動免疫分析儀及其套餐試劑盒測定cTnⅠ；全自動生化分析儀測定血清中的CK。

1．8 統計學處理數據以均數±標準差(x±s)表示，應用SPSS 10.0軟件進行數據統計，同組前后使用配對t檢驗，組間比較應用方差分析。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2．1 芪丹通脈片對缺血/再灌注大鼠心肌梗死面積的影響缺血/在灌注后的心臟經Evan’s蘭染色后，染色的缺血區(qū)呈磚紅色，而梗死區(qū)為灰白色。B組心肌梗死面積占缺血區(qū)的49.1％±10.3％，C組、D組心肌梗死面積分別為36.7％±8.9％和28.8％±8.4％，與B組比較均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2．2 芪丹通脈片對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響TUNEL染色結果顯示，凋亡心肌細胞核縮小，染色不均，細胞核被明顯染成棕紅色。B組心肌細胞凋亡指數為21.3±4.2，C組、D組為14.3±3.8和10.6+2.0，與B組比較，芪丹通脈片能夠減少心肌細胞的凋亡指數(P＜0.05或P＜0.01)。

2．3 芪丹通脈片對缺血/再灌注損傷大鼠血清CK和cTn Ⅰ影響再灌注4 h后B組血清CK和cTh Ⅰ分別為12.801 84U/L±4102 70U/L和64891ng/mL±13.03ng/mL，與A組(1552 83 U/L±451.07U/L和1.40 ng/mL±0.64 ng/mL)比較有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)；而不同劑量芪丹通脈片處理組再灌注后血清中CK和cTn Ⅰ的含量分別為10 017 17U/L±3345 46U/L與6973 50U/L±177.8 40U/L和47.23 ng/mL±12.76 ng/mL與35.13ng/mL±14.42 ng/mL，與B組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討 論

缺血性心臟病的病理改變是缺血心肌細胞因缺氧而壞死或凋亡，盡早恢復血液灌流是治療缺血性心臟病的首要措施。然而，再灌注損傷成為病人從缺血后復流獲益的最大障礙。通過包括預處理和后處理等措施能夠抑制缺血/再灌注所致的心肌損傷。然而，在臨床應用時，預處理和后處理均需準確預見到缺血或再灌注發(fā)生的時間；需要準確控制短暫間歇性循環(huán)缺血一再灌注實施的時間；機械刺激的方式力度的掌握均影響保護效應。這些固有的缺陷給應用上述兩種機械方式獲得保護心肌的作用帶來困難。因此發(fā)現模擬其作用的藥物對于臨床抑制再灌注后心肌的損傷有重要意義。

凋亡是導致缺血/再灌注損傷、心肌細胞丟失的重要病理形式之一。雖然缺血和再灌注過程與心肌細胞凋亡發(fā)生的相關性還存在爭論，但三磷酸腺苷(ATP)在缺血期的缺少和再灌注期間恢復的變化特點與凋亡的能量依賴特征為再灌注中凋亡的存在提供了直接證據。盡管再灌注導致心肌細胞凋亡的機制尚不清楚，但大量實驗研究結果顯示：通過預處理或后處理策略減少再灌注心肌細胞的凋亡能有助于心肌功能恢復。CK作為心肌受損的重要指標，動態(tài)監(jiān)測CK的水平，并計算CK時間下的面積能夠反映再灌注后心肌損傷的程度，臨床應用該面積作為評價再灌注成功與否的指標。cTn Ⅰ是反映心肌損傷的敏感血清學指標，也是反映心肌損傷的特異性指標。

芪丹通脈片主要成分為黃芪、丹參、紅花、當歸、桂枝等。方中黃芪、丹參配伍益氣活血，化瘀而不耗氣傷血，共為君藥，當歸、紅花為臣，補血活血，桂枝為佐使藥，辛溫通陽，疏通脈絡，并兼引諸藥歸于心經之力。諸藥配伍，具有益氣活血、化瘀通脈的功效。既往有研究表明其可增加血清中內皮生長因子的表達。在本實驗中，藥物連續(xù)灌胃7 d后，應用結扎大鼠冠狀動脈左降支制備急性I/RI模型，研究發(fā)現，染色后不同組心肌中出現藍色、紅色和灰白色的區(qū)域，模型制備成功。而不同劑量的芪丹通脈片組均能夠使缺血(40 min)/再灌注(4 h)所致的心肌梗死范圍減小，并能夠降低再灌注后心肌細胞的凋亡指數，與對照組均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。研究中發(fā)現芪丹通脈片能夠抑制缺血/再灌注所致的大鼠血清CK和cTn Ⅰ增高，表明芪丹通脈片能夠抑制了缺血/再灌注對大鼠心肌的損傷程度。因此，芪丹通脈片能夠提高心肌細胞對再灌注損傷的耐受能力，抑制再灌注所致的心肌細胞凋亡和心肌組織的破壞。其機制有待進一步研究。

本文編輯 王雅潔