復方丹瓜方對培養(yǎng)ＥＣＶ ３０４增殖及形態(tài)影響的研究

摘要：目的：探討體現(xiàn)痰淤同治法的中藥復方丹瓜方對培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV 304)增殖及形態(tài)的影響，以揭示丹瓜方在防治糖尿病高血糖致血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用。方法：以標準的M199培養(yǎng)液、高糖(22.22 mmol/L)培養(yǎng)液、不同濃度的丹瓜方培養(yǎng)液、高糖加不同復方丹瓜方培養(yǎng)液培養(yǎng)ECV 304，觀察內(nèi)皮細胞生長情況及顯微形態(tài)變化。結(jié)果：不同濃度丹瓜方對培養(yǎng)ECV 304細胞的增殖、形態(tài)都具有明顯影響，濃度越高對細胞增殖的抑制作用越明顯；不同濃度丹瓜方均具有促進培養(yǎng)的ECV304多形性及“偽足樣”結(jié)構形成作用，適當?shù)す戏綕舛?如1/450)作用顯著；過高據(jù)(22.22mmol/L)，相當于臨床重度高血糖的糖尿病病人對培養(yǎng)的ECV 304也具有抑制作用；丹瓜方和過高糖對細胞的抑制作用不形成疊加。結(jié)論：丹瓜萬對培養(yǎng)的ECV304具有明顯的抑制增殖作用，對細胞形態(tài)也有明顯的影響。

關鍵詞：痰瘀同治；丹瓜方；血管內(nèi)皮細胞；動脈粥樣硬化；糖尿病

中圖分類號：R587.1 R289.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0844－03

痰瘀同治法臨床廣泛用于糖尿病慢性并發(fā)癥的治療。糖尿病病人痰瘀同病者相當常見，是導致糖尿病慢性并發(fā)癥泛發(fā)的基礎。及時合理應用痰瘀同治法，能有效地預防和治療糖尿病的多種慢性并發(fā)癥，尤其是慢性血管并發(fā)癥。為此我們對丹瓜方進行系列研究，本研究著重對丹瓜方培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及形態(tài)的影響進行觀察。

1 材料與方法

1．1 內(nèi)皮細胞：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)，購于武漢大學典型物保藏中心(美國ATCC產(chǎn)品)。

1．2 丹瓜方組方：丹參、川芎、瓜蔞、薤白等按等比組成，所有中藥材均經(jīng)專業(yè)人士鑒定，由福建中醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院制劑室制成1.1藥液，加壓蒸氣滅菌。該制劑電解質(zhì)經(jīng)測定均在人血液電解質(zhì)正常值波動范圍。不含重金屬。

1．3 實驗分組

1．3．1 不同濃度丹瓜方加高糖培養(yǎng)的比較，標準培養(yǎng)組：月標準培養(yǎng)液培養(yǎng)。標準培養(yǎng)液以M199培養(yǎng)基加入10％胎牛血清、雙抗、超蒸水，并加NaHCO₃調(diào)整pH值。全培養(yǎng)液含葡萄糖濃度為5.55 mmol/L。高糖培養(yǎng)組：葡萄糖濃度為22.22 mmol/L，余同標準培養(yǎng)組。1/150中藥加高糖組：高糖培養(yǎng)液每150 mL中含1.1丹瓜方液1 mL(相當于原生藥1g)。1/300中藥加高糖組，高糖培養(yǎng)液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL。

1．3．2 不同濃度丹瓜方、單獨高糖培養(yǎng)間的比較，標準培養(yǎng)組同前實驗；高糖培養(yǎng)組同前實驗；1/150中藥培養(yǎng)組：標準培養(yǎng)液每150mL中含1.1丹瓜方液1mL，1/300中藥培養(yǎng)組：標準培養(yǎng)液每300mL中含1.1丹瓜方液1mL；1/450中藥培養(yǎng)組：標準培養(yǎng)液每450 mL中含1.1丹瓜方液1mL。各組培養(yǎng)液pH值均控制在7.2～7.6。

1．4 傳代與培養(yǎng)方法：吸掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞兩次。加入胰酶溶液(1 mL/25cm²，2 mL/75cm²)，作用4 min～7/min，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞皺縮、變圓、彼此分離或呈大片狀分離，即加入適量含血清的培養(yǎng)液終止消化。反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，并于倒置顯微鏡下觀察確定。用吸管將懸液移入離心管中，以1 000 r/mm轉(zhuǎn)速離心4 min～5min 。去掉上清液，加入相應的新培養(yǎng)液，吹吸混勻成細胞懸液。細胞計數(shù)，根據(jù)細胞數(shù)量按比例接種到新的培養(yǎng)瓶，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三代細胞用于本實驗，每6 h觀察記錄1次。

2 結(jié) 果

2．1 不同濃度中藥加高糖培養(yǎng)的比較ECV304細胞在標準M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，長勢良好，分布均勻，細胞飽滿、大小一致，呈橢圓形或梭形。繼續(xù)培養(yǎng)至第3天，細胞貼滿了整個培養(yǎng)面。同期的高糖，細胞分布較雜亂，胞體較瘦小，細胞質(zhì)色彩變淡，細胞核深黑，有細長細胞出現(xiàn)，有的形似小蝌蚪。放大觀察倍數(shù)可發(fā)現(xiàn)較多的多形細胞。細胞數(shù)量與標準培養(yǎng)液接近。第3天時，高糖培養(yǎng)細胞大多有黑色“偽足樣”結(jié)構，以2支為多見，3支、4支者也常見。1/150中藥組和1/300加高糖組兩組同期細胞，細胞排列紊亂、稀疏，有的成堆，細胞數(shù)量偏少，尤其1/150中藥組為重。其他情況與高糖培養(yǎng)相似。

2．2 不同濃度中藥、單獨高糖之間的比較，標準培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h時，與前述標準培養(yǎng)液相似。高糖培養(yǎng)12 h多形細胞出現(xiàn)，胞核更黑，胞體較標準培養(yǎng)液組瘦小。單純中藥1/150組及1/300組，胞體、胞核明顯較小，細胞有成堆現(xiàn)象，細胞數(shù)量明顯少于標準組與單純高糖組。中藥1/450，組情況介于標準培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組及1/300中藥組之間，細胞數(shù)量不少。培養(yǎng)第3天，標準培養(yǎng)液細胞成梭形，少量三角形細胞，胞體飽滿，色彩均勻，細胞排列整齊。高糖培養(yǎng)組，細胞排列較紊亂，胞核更黑，有大量多形核細胞和“偽足樣”結(jié)構細胞，形態(tài)極不規(guī)則，細胞數(shù)量稍少于標準培養(yǎng)液組。1/150中藥組如圖10，細胞數(shù)量稀疏，胞體明顯較小，胞核小且著色較淺，有的細胞核已不明顯，細胞周圍形成小的雙層較明亮的環(huán)，細胞輪廓多不太清楚，有少量伸出“偽足樣”結(jié)構的細胞。1/300中藥組，細胞有大約1/3類似1/150中藥主體細胞形態(tài)，但伸出“偽足樣”結(jié)構的細胞明顯更多，細胞輪廓清楚。1/450中藥組，細胞以有“偽足樣”結(jié)構的細胞為主體形態(tài)，多形性明顯，數(shù)量及比例均多于高糖培養(yǎng)組，胞核及“偽足樣”結(jié)構呈深黑色。第4天、第5天1/150、1/300中藥組細胞約近半數(shù)死亡，高糖培養(yǎng)組與1/450中藥組細胞成活情況相似。所有中藥組細胞均較高糖培養(yǎng)組細胞更為瘦小。

3 討 論

痰瘀是中醫(yī)基本理論體系中最具特色的病理概念之一。它既是疾病的產(chǎn)物，也是進一步導致疾病發(fā)展變化的內(nèi)在原因，同時又是一種病理存在形式。因此，充分研究和認識痰與瘀的內(nèi)涵，對于豐富和發(fā)展中醫(yī)理論，提高中醫(yī)藥防病治病的療效及科學性，都是很有意義的。糖尿病作為頗具特色的氣血津液疾病，在其病理過程中生痰生瘀幾乎是疾病進展的常態(tài)。隨著痰與瘀作為病理產(chǎn)物逐漸產(chǎn)主，同時也作為致病因素導致或加重了糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生或發(fā)展。痰與瘀在糖尿病進程中的這種特殊角色，決定了其具有進展性、普遍性和病程相關性(病程越長越常見)特點。因此痰瘀同治法在糖尿病慢性并發(fā)癥的防治中具有關鍵作用，且確可能形成突破。我們在長期臨床工作中用痰瘀同治法治療糖尿病血管神經(jīng)慢性并發(fā)癥，取得了可靠的療效。

已有體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葡萄糖培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞可破壞細胞形態(tài)，抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡。劉小鵬等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高糖(11 mmol/L)處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常血糖(5.5 mmol/L)對照組(P＜0.05或P＜0.01)，但臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)22 mmol/L。葡萄糖作用72 h后，血管內(nèi)皮生長因子mRNA水平不再升高，而呈下降趨勢(P＜0.05)，血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達也逐漸下降。血管內(nèi)皮生長因子的生物學作用主要為促進內(nèi)皮細胞增殖，提高血管的通透性，增加微血管特別是毛細血管后靜脈和小靜脈的滲透性及改變細胞外基質(zhì)。在某些生理或病理情況下都與血管形成和增生密切相關。可見適當高糖促進內(nèi)皮細胞增殖，而過高葡萄糖濃度(簡稱“過高糖”，即≥22.22mmol/L)則抑制細胞增殖。本研究22.22 mmol/L的葡萄糖總體上顯示出對細胞抑制效應，與上述研究基本符合，但發(fā)現(xiàn)過高糖促成了“偽足樣”結(jié)構的形成，這使得培養(yǎng)細胞形成多形性的特征。不同濃度丹瓜方均對培養(yǎng)細胞具有抑制作用，表現(xiàn)為胞體的瘦小及不同程度數(shù)量的減少。丹瓜方似乎具有較過高糖更為濕著的細胞增殖抑制作用。1/150丹瓜方組由于細胞成活相對較少，這種促進作用不甚顯著，但在1/300，1/450的丹瓜方培養(yǎng)液中，隨著中藥濃度的降低，細胞成活增多，“偽足樣”結(jié)構細胞也顯得較多。但在中藥聯(lián)合高糖培養(yǎng)情況下，未發(fā)現(xiàn)這種促進作用的疊加。

通過本實驗可初步得出下列認識，不同濃度月瓜方對培養(yǎng)ECV 304細胞的形態(tài)、增殖都具有明顯影響，濃度越高對細胞的抑制作用越顯著，不同濃度丹瓜方均具有促進培養(yǎng)的ECV304細胞多形性及“偽足樣”結(jié)構形成作用，適當月瓜方濃度(如1/450)這種作用極為顯著；過高糖(22.22 nmLol/L，相當于臨床重度高血糖的糖尿病病人)對培養(yǎng)的ECV304也具有抑制作用；丹瓜方和過高糖對細胞的抑制作用不形成疊加。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)具有“偽足樣”結(jié)構的細胞列秋水仙堿細胞毒的耐受性顯著增加。

本文編輯 王雅潔