癲癇靈顆粒對戊四唑致癇大鼠Ｃ－ｆｏｓ蛋白及熱休克蛋白－７０表達的影響

摘要：目的觀察癡癇靈顆粒對戊四唑致癰大鼠腦內C－fos及熱休克蛋白－70(hsp－70)含量的影響。方法隨機將72只大鼠分力6組，通過與陽性藥物組及模型組的比較，研究癲癇靈顆粒抗癲癇作用的機制。結果：研究表明癲癇靈顆粒可顯著減輕大鼠癲癇發作，可使戊四唑致痛大鼠的大腦中減少C－fos蛋白釋放，降低hsp－70在大鼠腦內的表達。結論：癲癇靈顆粒具有良好的抗癲癇效果，可減輕大鼠癲癇發作對大腦的損傷。

關鍵詞：癲癇靈顆粒，C－fos，蛋白；熱休克蛋白－70

中圖分類號：R392.5 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672－1349(2007)09－0827－02

本實驗通過觀察戊四唑(PTZ)致癇大鼠腦內C－fos蛋白及熱休克蛋白－70(hsp－70)含量的變化，探討癲癇靈顆粒對戊四唑致癇大鼠抗癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重200g±12g，黑龍汀中醫藥大學提供。

1．2 藥物、試劑與儀器戊四唑，使用前2 h用生理鹽水配制；癲癇靈顆粒(組方：天麻、鉤藤、石決明、柴胡、天竹黃、磁石、生龍骨、甘草等)，由黑龍江中醫研究院制劑室提供；卡馬西平由上海第六制藥廠提供，一抗由博士德生物工程有限公司提供，二抗由中杉生物工程有限公司提供；輪轉式組織切片機，徠佧2135型，德國，研究用生物顯微鏡，OLYMPUSBX60，日本；CMIAS系列數碼醫學圖像分析系統，Motic Med 6.0，中國。

1．3 方法72只大鼠隨機均分為6組，每組12只，分別為空白組、模型組、卡馬西平對照組、癲癇靈高劑量組、癲癇靈中劑量組、癲癇靈低劑量組。其中空白組、模型組予飼雙蒸水2 mL/d，卡馬西平對照組組予卡馬西平9 mg/(kg·d)，癲癇靈組高、中、低劑量組濃度按9:3:1配制，分別飼藥14 d。第15天除空白組外均予戊四唑50 mg/kg腹腔注射，對大鼠進行行為學觀察，于1 h后腹腔注射10％水合氯醛麻醉，開胸暴露心臟，升主動脈插管，以生理鹽水250 mL和含體積分數為25％的戊二醛、20 g/L多聚甲醛的0.1mol/L PBS固定后，斷頭活殺，迅速取出全腦，沿腦正中矢狀切開，取一半大腦于相同固定液中固定24 h(4℃)，次日以40/μm厚度進行冷凍切片，行連續冠狀切片，檢測皮質內C－fos蛋白及hsp－70。

1．4 觀察項目參考Racme癲癇發作分級標準觀察觀察大鼠癲癇發作分級并記錄，運用CMIAS系列數碼醫學圖像與分析系統記錄各組C-fos蛋白及hsp－70陽性細胞密度。

1．5 大鼠驚厥發作評分標準 參考Racme癲癇發作分級標準，0級：無反應；Ⅰ級：節律性嘴和面部抽動；Ⅱ級：點頭或甩尾；Ⅲ級：單肢抽動；Ⅳ級：多肢抽動和強直；Ⅴ級：全面性強直陣攣發作。

1．6 統計學處理運用SPSS10.0軟件處理數據結果。

2 結 果

2．1 大鼠行為學觀察。

2．2 C－fos蛋白及hsp－70含量

3 討 論

癲癇的病因病機十分復雜，中醫學認為其歸屬于癇證范疇。其病因有先后天之分，而又強調七情為患。傳統認為風陽痰濁蒙蔽心竅，流竄經絡，是造成癇證發作的基本病理因素。對癲癇單純部分性發作多從肝風夾痰論治，本證型的臨床特征是發作時意識尚清，或突然神呆，兩目凝視，可見手足抽動，或見煩渴、自汗、顏面潮紅、腹痛吐瀉、妄聽妄視等種種見證，多伴有面色蒼白、倦怠乏力、納呆、大便秘結或溏泄、舌苔自膩、脈弦滑等肝風夾痰的臨床表現。而癲癇靈顆粒組方中天麻、鉤藤、石決明平肝熄風，柴胡疏肝解郁、推陳致新，天竹黃化痰定驚，生龍骨、磁石潛陽安神，甘草調和諸藥。全方共奏平肝潛陽、鎮靜安神之功。

本實驗中選擇了戊四唑致病大鼠模型，它是目前應用較多的大鼠癲癇模型之一，PTZ是中樞神經系統興奮劑，功能減弱可使神經元過度興奮，引起癲癇發作。正常對照研究表明，腹腔給予PTZ(50 mg/kg)后1 min－2 mm即可引起動物Ⅱ級癲癇發作，且發作頻繁，可持續1 h以上。這個模型類似于癲癇單純部分性發作。

神經遞質受體信號通過細胞內第二信使系統可以直接引起一些基因的轉錄，也可以迅速激活某些調節基因，并表達出相應的調節蛋白質，再通過這些調節蛋白選擇性結合于有關DNA，引起另一些基因(次級靶基因)的表達，從而較長時間地改變神經元的結構和功能，產生生物學效應。現已證明C－fos，C－jun等即屬這類調節基因。它們在神經沖動、神經遞質、激素等外界刺激信號傳人的數分鐘內即可作出反應進行表達。這些基因表達的調節蛋白也稱核內第三信使。它們在其信息傳遞過程中起著重要作用。神經元興奮可導致C－fos蛋白快速、大量、一過性表達，因此，C－fos蛋白的表達可作為細胞水平神經元興奮的特異性標記物。用免疫組織化方法顯示C－fos蛋白是目前使用的機能形態學方法之一。有研究發現C－fos基因存在于哺乳動物的神經細胞核內，在神經系統癇性活動情況下可被快速誘導，從而導致神經元的可塑性變化和效應基因表達的永久性改變。對突變體癲癇易感小鼠研究發現，在癲癇發作期間C－fos基因顯著表達，同時在小鼠大腦海馬CA1區和頂葉皮質能檢測到細胞DNA的斷裂，認為伴隨癲癇的發作有C－fos基因轉錄產物C－fos蛋白所誘發的激活作用的級聯反應，它在凋亡最初的激活和最后的失活過程中導致了DNA的斷裂，參與了癲癇病灶的形成。

而hsp－70是機體在遭受各種刺激后，誘導產生的一組應激蛋白。hsp－70是熱休克蛋白中最保守和最主要的一類，在細胞應激后生成最為顯著，被認為對神經元損傷具有保護作用。當神經元受損時，hsp－70表達后分別在胞漿和胞核中同變性蛋白結合，防止變性蛋白進一步折疊，促使其恢復或加速其降解和消除，維持神經元內蛋白自穩，以維護細胞的功能和生存。目前，神經元受損時，hsp－70表達對受損神經元的保護作用已基本肯定，因此，hsp－70在腦內表達的速度及數量在一定程度上影響神經元對癲癇興奮性損傷的耐受性，并可能是癲癇腦內神經元選擇性脫失的內在機制之一。

本實驗中癲癇靈顆粒對戊四唑致癇大鼠大腦C－fos蛋白及hsp－70的合成有明顯抑制作用，能夠顯著控制癲癇發作，減輕神經元在癲癇發作時的興奮性損傷。對其具體作用途徑尚有待進一步研究。

本文編輯 王雅潔