川崎病患兒循環內皮細胞的變化及意義

摘要：目的：了解川崎病(KD)患兒外周血循環內皮細胞(CEC)的數量及其臨床意義。方法：采用密度梯度離心法和流式細胞儀檢測28例KD患兒30名正常兒童的血液標本。結果：KD患兒和正常兒童的CEC數量分別是(7.8±4.2)/mL和(3.7±1.1)/mL，兩者之間的差異有統計學意義(P＜0.01)；冠狀動脈損傷組(CAL組)患兒CEC數量(9.7±1.9)/mL，高于無冠狀動脈損傷組(Non-CAL組)患兒的(5.5±2.6)/mL，兩者之間的差異有統計意義(P＜0.11)。結論：內皮損傷在KD患兒的發病中具有重要意義，測定CEC對判斷病情及有無冠狀動脈病變有重要意義。

關鍵詞：川崎病；循環內皮細胞；冠狀動脈

中圖分類號：R725.4 文獻標識碼：B 文章編號：1672－1349(2007)09－0884－02

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種以全身血管炎為主要病變的急性發熱出疹性疾病，這種血管炎以免疫系統活化和血管內皮系統廣泛損害為特征，是心血管系統病理損傷的重要基礎。KID多侵犯冠狀動脈，已取代風濕熱并成為我國小兒后天性心臟病的主要病因之一。其發病機制仍不清楚，既往的研究發現一些自身抗體與細胞因子可能與KD血管損傷過程有關。循環內皮細胞(circulating endothelial cell，CEC)是指外周血中測得的血管內皮細胞(vascular endothehal cells，VEC)，其數量的變化可反映血管內皮受損的程度，是目前唯一可作為活體組織中反映VEC損傷的直接而特異的標志物，因而越來越受到國內外學者的廣泛關注，但在KD患兒中的研究報道不多，其是否與冠狀動脈病變的形成有關尚不清楚。本研究對28例KD患兒的CEC數量進行檢測，旨在探討內皮損傷在KD中的意義，以及CEC與合并冠狀動脈病變之間的關系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料：川崎病組28例為2006年1月－2007年5月住院的KD患兒，其中男15例，女13例，年齡2月至6歲，病程6d～18d。均符合日本MCLS研究會1984年修訂的診斷標準。根據KD患兒心臟彩色多普勒檢查結果將其分為兩組：合并冠狀動脈損傷組(CAL組)12例，無冠狀動脈損傷組(Non－CAL組)16例。全部病例均給予阿司匹林聯合靜脈丙種球蛋白(IVIG)治療。對照組為30名健康體檢兒童，男18名，女12名，年齡6個月至6歲，均排除了心、肺、肝、腎等疾病，年齡及性別與川崎病組差異無統計學意義。

1．2標本采集：抽取急性期(發熱5d～7d，丙種球蛋白治療前)KD患兒和對照組兒童肘正中靜脈血5 mL，加入枸櫞酸鈉真空采血管(美國BD公司產品)中，棄去最初采集的2 n1IJ血，以避免靜脈穿刺時脫落的內皮細胞摻入。新鮮樣本6h之內進行樣本處理。

1．3 儀器與試劑：EPICS PROFILEⅡ型流式細胞儀(Coulter，美國)；ACAS Ultlma激光共聚焦顯微鏡(Meridian，美國)；兔抗人多克隆yon Willebrand因子抗體(yWF)和FITC－羊抗兔IgG(軍事醫學科學院，中國)；1.060 g/mL和1.045 g/mL Peroall分層液(中國醫學科學院血液學研究所)，FITC－CD31小鼠抗人單克隆抗體(Coulter，美國)。

1．4 實驗方法：CEC的鑒定，取細胞懸液少許涂片，干燥后用甲醇固定5 min，用PBS漂洗3次，干后滴加免抗入因子Ⅷ相關抗原血清，置于37℃中孵育30 min后取出，再次用PBS漂洗3次，干后滴加FITC標記的羊抗兔IgG；熒光抗體，于后滴加緩沖甘油，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1．5 統計學處理：應用SPSS11.5統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2．1 川崎病組與對照組CEC數量比較川崎病組CEC數量為(7.8±4.2)/mL，高于對照組的(3.7±1.1)/mL，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2．2 川崎病CAL組與Non－CAL組CEC數量比較，CAL組患兒CEC數量為(9.7±1.9)/mL高于Non－CAL組的(5.5±2.6)/mL，相比差異有統計學意義(P＜0.01)。

3 討 論

CEC可直接而特異地反映活體內內皮細胞(EC)的損傷情況，且主要反映EC的脫落性損傷。在某些病理情況下，VEC自基膜脫落至血管腔內，形成CEC，使CEC數量明顯增加，這種變化可靈敏地反映血管內皮的損傷程度。因此，CEC可作為活體內血管損傷特異而直接的指示物。CEC是判定血管炎的最佳標記物，尤其是在判定抗中性粒細胞胞漿抗體相關的血管炎中，其敏感度要遠遠超過現用的抗中性粒細胞胞漿抗體效價。

本研究的結果顯示，KD組的CEC較對照組明顯增多(P＜0.01)，表明KD存在有VEC的損傷及脫落，與文獻報道一致。川崎病內皮細胞損傷的機制有，川崎病時免疫系統異常活化和紊亂，使大量細胞因子和炎性介質被釋放，如白細胞介素、γ－干擾素、腫瘤壞死因子和超氧自由基等。這些異常增多的炎性介質既可直接損傷血管內皮細胞，也可誘導機體產生抗內皮細胞抗體(AEA)、抗中性粒細胞抗體(ANCA)及抗血小板抗體等自身抗體，而發生自身免疫性反應，使血管內皮細胞損傷甚至壞死，而致血管壁的損害。因此可以說CEC是KD內皮細胞損傷的標志物D2J。本研究的另一結果顯示，CAL組的CEC較Non-CAL組顯著增多(P＜0.01)，提示VEC的損傷與冠狀動脈損傷呈正相關，CEC的損傷是導致冠狀動脈損傷的原因。當然，這一結論還需要有大樣本研究進一步證實。

檢測CEC的方法有多種，主要可分為形態識別計數法、間接免疫熒光抗體法和免疫熒光流式細胞儀計數法等三類。前兩類方法雖然簡單，易于建立，但實驗回收率不高，靈敏度也差，并且費時。本實驗應用密度梯度離心的方法從全血中分離CEC，克服了以往方法的缺點，如研究的血液標本不同、分選的方法不同，以及計數的方法不同等等的弊端，具有客觀、準確、省時、特異性強及回收率高、取血量少、對內皮細胞損傷小的特點。而且本實驗采用流式細胞儀分選的方法，避免了單純用肉眼進行識別的錯判，可用于不同疾病病人血液中CEC的定量檢測，值得在臨床推廣。目前又有一種新的方法——免疫磁珠分選方法問世，該法用血量少，回收率達80％～90％，靈敏度高，特異性強，更為先進。

CEC可作為川崎病血管病變中內皮細胞損傷的標志，預示川崎病發生血管損傷的危險性，了解冠狀動脈損害的狀況，減輕川崎病對小兒的威脅，為進一步治療提供理論依據。

本文編輯 王雅潔