ＰＭＡ誘導單核細胞分化過程中基質金屬蛋白酶９的表達及其活性的變化

文章編號：1008-6919（2007）09-0098-02中圖分類號:R817.4文獻標識碼：A【基礎醫學】

【摘要】 目的 應用單核細胞向巨噬細胞分化的體外模型，研究單核細胞向巨噬細胞細胞分化過程中基質金屬蛋白酶-9表達及其活性的變化.方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA) 孵育THP-1細胞不同時間，采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態學變化，RT-PCR觀察MMP-9 mRNA表達的變化，Western blot觀察MMP-9蛋白表達的變化，明膠酶譜(gelatin-zymogram)分析法測定MMP-9活性的變化。結果THP-1細胞經PMA孵育后， 細胞由分散、懸浮轉變為黏附、貼壁， 且MMP-9的表達明顯上調，活性增加.結論 單核細胞向巨噬細胞分化的過程中，MMP-9的表達量及其活性明顯增加。

關鍵詞：PMA 單核細胞 巨噬細胞 基質金屬蛋白酶9

1 前言

MMP－9 是明膠酶的一種，單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、血管平滑肌細胞、以及內皮細胞等均有表達[1]，參與降解細胞外基質（ECM），在多種生理和病理過程中起著重要作用。為此，我們采用單核細胞向巨噬細胞分化的體外模型，探討單核細胞在分化為巨噬細胞的過程中MMP-9表達的變化，進一步探討動脈粥樣硬化發生發展的機制。

2 材料和方法

2.1 THP-1細胞培養

THP-1細胞購自中科院上海細胞生物所細胞中心。含10%小牛血清RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2條件下培養至106/ml時換無血清培養基，加PMA（至終濃度為100nM）[2]，分別孵育6、12和24小時。

2.2 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達[3]

用TRIZOL RNA抽提液提取細胞總RNA，RNA濃度以紫外分光光度計(美國PE公司Lambda25型)重復測量3次，A260nm/A280nm比值在1.8以上方可用。取1.0μg總RNA為模板，以Oligo（dT）16為引物進行逆轉錄。反應條件為65℃變性5min，42℃反應50min，70℃終止反應15min。擴增MMP-9的引物為：有意義序列引物5’-CGGGACGGCAATGCTGATG-3’，反義序列引物5’-CGCCACGAGGAACAAACTGT-3’， 預計擴增引物全長為362bp。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）為內對照，擴增GAPDH引物為：有意義引物序列5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’， 5’ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧ 3’，下反義序列引物:5’ＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＧ 3’，預計擴增引物全長為697bp，均由上海生工合成。取逆轉錄產物2μL分別進行聚合酶鏈反應。反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，退火45s，72℃延伸1min。退火溫度SDF-1為58℃，GAPDH為58℃。經28個循環后，72℃延伸10min。取5μL聚合酶鏈反應產物作瓊脂糖凝膠電泳。并利用凝膠成像系統作結果分析。

2.3 Western blot 檢測MMP-9蛋白表達

經8%SDS-PAGE分離樣品蛋白質，轉移緩沖液在200mA、100V條件下電泳6h后轉膜，洗膜，封閉液封閉。分別加入一抗，4℃輕輕振蕩約2h，漂洗，加過HRP標記的二抗雜交，再漂洗，顯色液顯色，暗室中感光，拍照并進行灰度掃描測定。

2.4 明膠酶譜法測定MMP-9活性[4]

酶原電泳在含0.1%明膠、10%SDS的8%聚丙烯酰胺凝膠中進行。電泳完畢后，將凝膠浸入2.5%Triton-100中復性30min，共2次，洗去SDS，恢復MMP-2、MMP-9活性。再將凝膠浸入酶解緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，pH 7.6、0.2mol/L NaCl、5mmol/LCaCl2、0.02%Brij35），溫育37℃ 18小時。用0.5%考馬斯亮蘭（10%冰醋酸、40%甲醇配制）染色90min后，10%冰醋酸、40%甲醇脫色至透明條帶與蘭色背景對比清晰即可。凝膠掃描，半定量測定MMP-9活性。

2.5 統計學處理

實驗數據用平均數±標準差( ±S)表示。采用SPSS10.0統計軟件進行單因素方差分析，兩兩均數間的多重比較，采用Student t檢驗，P<0.05為差異達到顯著水平。

3 結果

3.1 PMA處理對THP-1細胞形態的影響

THP-1細胞和PMA孵育6h后，細胞形態開始發生改變，由懸浮型轉變為貼壁型，到24h時，基本貼璧，但細胞外型依然為圓形，細胞表面伸出偽足，細胞體積增大，胞漿內出現空泡。

3.2 PMA對THP-1細胞 MMP-9 mRNA表達的影響

RT-PCR結果表明，在單核細胞中有MMP-9 mRNA基礎表達，在經PMA孵育后，隨著孵育時間的延長，MMP-9 mRNA表達量明顯增加。

3.3 PMA對THP-1細胞 MMP-9 蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，與RT-PCR檢測結果基本一致，在單核細胞中即有MMP-9蛋白表達，在經PMA孵育后，隨著PMA孵育時間的延長，MMP-9蛋白表達量明顯增加，到6h時，與對照組相比，差異具有顯著性（P<0.05）。

3.4 PMA對THP-1細胞 MMP-9活性的影響

用含明膠的SDS-PAGE 對培養液上清中的MMP-9活性檢測結果表明，在經PMA孵育后，在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中，MMP－9的活性明顯增加。

4 討論

循環血液中的單核細胞在黏附分子和單核細胞趨化蛋白的作用下，黏附于血管內皮，再穿過內皮細胞間連接遷入內皮下間隙。進入內皮下間隙的單核細胞被激活，分化為巨噬細胞。Shigeru等證實在將單核細胞與PMA孵育24小時后轉化為成熟的巨噬細胞，為良好的體外單核細胞分化為巨噬細胞細胞模型。在我們的實驗中，我們也觀察到單核細胞與PMA孵育后，到6h時，細胞表型即發生了明顯變化，細胞開始貼璧，到24h時，細胞幾乎完全貼璧，并且細胞體積增大，細胞邊緣伸出偽足，胞漿內出現空泡，形成巨噬細胞的形態結構。

在AS 損傷中，富含脂質的巨噬源性泡沫細胞聚集是易破斑塊的重要特征，其中病灶區MMP－9表達的增加可能在斑塊破裂中起重要作用 [5]。對AS 高膽固醇血癥的家兔模型的動脈損傷處分離的細胞進行培養，發現這種明膠水解活性酶主要來源自巨噬源性泡沫細胞。我們的研究進一步發現，在單核細胞分化為巨噬細胞過程中，尚未形成泡沫細胞，MMP-9的表達量與活性即有明顯上調。因此我們推測在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中，MMP－9的表達及活性增加，一方面增加ECM的降解，從而有利于平滑肌細胞的遷移，促進動脈粥樣硬化病變的發生和發展，另一方面加速斑塊中膠原的降解，從而降低斑塊的強度，促使斑塊破裂。

綜上所述，在單核細胞分化為巨噬細胞過程中，MMP-9表達量及活性的改變，可能對動脈粥樣硬化的發生發展以及斑塊的穩定性起著重要的調節作用。

參考文獻

1王梅芳，楊林花. MMP-9 與冠狀動脈粥樣硬化. 臨床心血管病雜志. 2004，20 （11 ）：699－701.

2周筠， 朱平， 蔣建利， 等. PMA誘導的THP21細胞分化過程中MMP29及MMP22的表達與細胞侵蝕性的關系. 細胞與分子免疫學雜志. 2005， 21 (2)：256－257.

3呂運成，王佐，危當恒，等. 基質細胞衍生因子1α—CXCR4趨化THP-1細胞遷移及氧化型低密度脂蛋白的影響. 中國動脈硬化雜志. 2007，15（1）：15－18.

4危當恒，萬臘香，劉錄山，等. 阻斷清道夫受體AI對巨噬細胞源性泡沫細胞基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達的影響. 中國動脈硬化雜志. 2003，11（2）：111－114.

5Papaspyridonos M， Smith A， Burnand KG， et al. Novel candidate genes in unstable areas of human atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 ，26(8):1837-44.