陜西韓城嚴(yán)重發(fā)生的小麥矮縮病病原鑒定與原因分析

摘要 2007年在陜西韓城發(fā)現(xiàn)一種新的小麥病毒病害，癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重矮縮、黃化、條斑和分蘗增多等，發(fā)病面積約0.07萬hm²，病田減產(chǎn)達50％，嚴(yán)重地塊甚至絕收。本研究通過對采集自我國陜西韓城的7個樣品進行PCR鑒定、全基因組序列測定及比較，證實陜西韓城樣品確是小麥矮縮病毒(WDV)侵染所致，并對發(fā)病原因及其流行趨勢進行了分析。這是小麥矮縮病在我國麥田大發(fā)生的首次報道。

關(guān)鍵詞 小麥矮縮病毒(WDV)；分子鑒定；發(fā)生

中圖分類號 S435.121.49

韓城市位于陜西省東北部，總面積1621 km²，有耕地面積2.67萬hm²，其中麥田面積1.57萬hm²，主要分為山、塬、川3種類型，面積分別為0.53萬、0.91萬hm²和0.13萬hm²。2007年春季，癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重矮縮、黃化、條斑和分蘗增多等的小麥病毒病害在北部地區(qū)的新城、西莊和龍門鎮(zhèn)等地嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病面積約為0.07萬hm²，發(fā)病田平均病株率為80％，嚴(yán)重矮縮病株約占20％，發(fā)病田減產(chǎn)達50％～80％。根據(jù)這些癥狀和發(fā)病特點，初步判斷是小麥矮縮病。

小麥矮縮病毒(WDV)是玉米線條病毒屬的成員，屬于第1亞組聯(lián)體病毒，基因組由2 739～2 750個核苷酸組成，編碼4個蛋白，包括運動蛋白(MP)、外殼蛋白(CP)、兩個復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep A和Rep)及兩個基因間隔區(qū)(LIR和SIR)。該病毒已經(jīng)在歐洲的很多國家有過報道，例如捷克、瑞典、匈牙利、法國、德國、和土耳其等。近年來，在非洲的突尼斯和贊比亞又有發(fā)現(xiàn)。發(fā)病后的小麥嚴(yán)重矮縮、黃化、條斑。該病害已經(jīng)在非洲、歐洲、亞洲和大洋洲引起了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

小麥矮縮病毒(WDV)的傳毒介體是條沙葉蟬(Psammotettix striatus)，寄主包括小麥(tristicumaestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avenasativa)和多種雜草。以前我國對該病毒未見記載，自2003年春季開始，本實驗室在全國不同小麥生態(tài)區(qū)進行田間調(diào)查，在許多地區(qū)發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重矮化，黃化且不能抽穗的小麥植株。基于這些癥狀，懷疑是由小麥矮縮病毒(WDV)所致。2007年本實驗室首次鑒定出山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗麥田發(fā)生嚴(yán)重矮化的小麥植株是由WDV侵染所致，從而證實了該病毒在我國的存在。本研究通過對韓城樣品進行PCR鑒定和序列分析，證實韓城樣品確由WDV侵染所致，結(jié)合當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)特點對發(fā)病原因及其流行趨勢進行了分析。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

2007年4月20～21日在陜西韓城采集表現(xiàn)嚴(yán)重矮化，分蘗增多，黃化且不能抽穗的小麥標(biāo)樣31個。記錄采集時間、地點、寄主、發(fā)病癥狀特點，并分別編號。帶回實驗室后剪成5～10 cm片段置-70℃保存。挑選其中的7個癥狀典型的樣品進行分析。

1．2 小麥矮縮病毒(WDV)的分子鑒定

1．2．1 植物總DNA的提取

提取方法參照Williamson等方法，由CTAB法提取，0.8％瓊脂糖電泳檢測DNA濃度，然后置于-20℃冰箱備用。

1．2．2 引物設(shè)計

依據(jù)GeneBank上已登錄的WDV不同地區(qū)分離物的基因組全序列，對其進行比對，利用VecterNT 9.0軟件，根據(jù)保守序列設(shè)計4對鑒定引物：245F/806R、245F/1 886R、1 381F/1 886R、1761F/435R和3對測序引物：40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R(引物序列見表1)。引物均合成于北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1．2．3 小麥矮縮病毒(WDV)分離物的PCR鑒定

利用設(shè)計好的4對引物，鑒定從陜西韓城采集的標(biāo)樣。PCR反應(yīng)體系為模板DNA20 ng，引物2 pmol/uL。10×Buffer 2.5 uL，dNTPs 2uL，Taq酶0.15 uL，用水調(diào)至終體積25uL。PCR反應(yīng)程序為94℃變性4 min；94℃45 s、56℃45 s，72℃1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖電泳檢測。用于PCR反應(yīng)的試劑購于TaKaRa生物技術(shù)公司。

1．2．4 小麥矮縮病毒(WDV)基因組全序列測定

用設(shè)計的3對測序引物擴增覆蓋小麥矮縮病毒(WDV)全基因組序列(擴增策略見圖1)，并將獲得的擴增片段連接到PMD18-T載體，試驗步驟參照PMD18-T試劑盒說明書進行。PCR鑒定陽性克隆并測序，最后對測序結(jié)果進行拼接。PMD18-T載體試劑盒購于TaKaRa生物技術(shù)公司，IPTG、X-gal、氨芐音霍素購自北京綠牛源牛物技術(shù)公司。

1．2．5 小麥矮縮病毒(WDV)基因組序列比較

利用Vecter NT 9.0軟件對獲得的7個陜西韓城小麥矮縮病毒(WDV)分離物序列和從GenBank下載的5個不同來源的小麥矮縮病毒(WDV)分離物序列進行序列相似性比較，并對其開放閱讀框和非編碼區(qū)的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析。利用MEGA 4.0對其進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1．2．6 小麥矮縮病發(fā)病原因調(diào)查分析

于2007年4月中旬調(diào)查了韓城市大田小麥矮縮病的發(fā)病率，發(fā)病地塊的介體昆蟲種類，蟲口密度，種植的小麥品種等。結(jié)合冬春氣象資料對小麥矮縮病大發(fā)生的原因進行了分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 小麥矮縮病毒(WDV)分離物的PCR鑒定

以已知陽性樣品(2004年的山西太原分離物，GeneBank登錄序列號DQ868528)[1胡作為陽性對照，用來鑒定于2007年4月采集自陜西省韓城市表現(xiàn)矮縮癥狀的小麥標(biāo)樣。結(jié)果顯示所有標(biāo)樣均能擴增出陽性條帶，4對引物245F/806R、1 381F/1886R、245F/1 886R、1 761F/435R分別擴增出562bp，506 bp，1 642 bp，2 275 bp的特異片段，大小分別與小麥矮縮病毒(WDV)基因中對應(yīng)引物之間的片段大小相吻合(圖2)。

2．2 小麥矮縮病毒(WDV)分離物核苷酸序列測定

以3對測序引物(40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R)PCR擴增韓城小麥標(biāo)樣，分別擴增出片段1、片段2、片段3(圖3)。對獲得的擴增產(chǎn)物進行克隆測序，并對測序結(jié)果進行拼接，最終獲得了7個WDV分離物的全序列。

2．3 小麥矮縮病毒(WDV)分離物基因組序列分析

通過對獲得的采集自陜西省韓城市的7個陜西韓城小麥矮縮病毒(WDV)分離物全序列和5個不同來源的小麥矮縮病毒(WDV)分離物的核苷酸序列進行相似性比較，其核苷酸序列同源性為97.1％～99.5％。其中的SXHC-10、SXHC-2與中國太原分離物(GenBank登錄號：DQ868528)序列同源性最高，為99.5％；選取SXHC-19的基因組開放閱讀框(ORF)、非編碼區(qū)(UTR)的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列序列與5個不同地區(qū)的WDV9離物相應(yīng)片段進行比較，發(fā)現(xiàn)這些核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列同源性也很高，分別達到96.39/5～99.6％和95.5％～100％(表2)。

在測定獲得的所有WDV標(biāo)樣中，其基因組結(jié)構(gòu)符合小麥矮縮病毒(WDV)基因組基本構(gòu)成。基因組ORFl起始于171位，在433位終止，編碼運動蛋白(MP)。ORF2起始于415位，終止于1 197位，編碼外殼蛋白(CP)。ORF3起始于2511位，在1 369位終止，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白Rep。ORF4起始于2 511位，在1 717位終止，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白RepA。SIR起始于1 198位，終止于1 369位。LIR在1～170位、2 512～2 750位，含有聯(lián)體病毒復(fù)制起始所需的“TAATATTAC”的9堿基保守序列和其他作用元件。

對SXHC-19號分離物與5個來自其他地區(qū)的WDV分離物基因組全序列核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析表明(圖4)：SXHC-19號分離物與其他5個不同來源的分離物均位于一個大組，與中國太原分離物(DQ868528)親緣關(guān)系最近。因此，引起陜西韓城小麥植株矮化、黃化、分蘗增多的病原是小麥矮縮病毒(WDV)。

2．4 小麥矮縮病發(fā)生與流行原因分析

2007年4月15～18日對韓城市麥田進行了普查，發(fā)現(xiàn)小麥矮縮病毒的傳毒介體條沙葉蟬普遍發(fā)生，平均蟲口密度為600頭/m²，其中北部塬區(qū)和山區(qū)發(fā)生最重，蟲口密度為1 000頭/m²，嚴(yán)重田塊達2 000頭/m²。發(fā)病小麥品種主要為小偃22和小偃6號新系，發(fā)病田平均病株率為80％，嚴(yán)重矮縮病株約占20％，發(fā)病田減產(chǎn)達50％～80％。對氣象資料分析表明，2006～2007年冬季氣溫偏高，有利于介體條沙葉蟬的越冬，而起2007年3月底至4月初又出現(xiàn)了低溫倒春寒的反常天氣，造成了小麥植株抗病性的降低，促進了矮縮病的發(fā)生。

3 討論

小麥矮縮病毒(WDV)于1961年在前捷克斯洛伐克首先報道，隨后在瑞典、匈牙利、法國和德國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。近年來，在西班牙、土耳其、美國、突尼斯、贊比亞和中國又有發(fā)現(xiàn)。發(fā)病后的小麥出現(xiàn)嚴(yán)重矮縮、黃化、條斑、不能抽穗等癥狀，使小麥產(chǎn)量大幅度降低。小麥矮縮病毒(WDV)已經(jīng)在非洲、歐洲、亞洲和大洋洲引起了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，而且有逐年上升的趨勢。

本研究對采集自我國陜西韓城的7個小麥矮縮病毒分離物進行了PCR鑒定、全基因組序列測定和分析。結(jié)果顯示，以4對鑒定引物PCR擴增所有韓城樣品，擴增出的條帶分別與小麥矮縮病毒(WDV)基因組中對應(yīng)引物之間的片段大小吻合。經(jīng)測序獲得的陜西韓城分離物基因組全序列大小與國內(nèi)外公布的小麥矮縮病毒(WDV)序列相符，基因組的開放閱讀框和非編碼區(qū)序列也與國內(nèi)外公布的小麥矮縮病毒(WDV)的結(jié)構(gòu)一致；系統(tǒng)進化分析表明陜西韓城分離物基因組與國內(nèi)外公布的小麥矮縮病毒(WDV)基因組也屬于同一個進化分支。本研究測定的陜西韓城分離物基因組全序列可以為其分類地位提供依據(jù)。

2004年以前小麥矮縮病毒在我國并未見報道。自2003年春季開始，本實驗室在全國不同小麥生態(tài)區(qū)進行田間調(diào)查，在許多地區(qū)發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重矮化，黃化且不能抽穗的小麥植株。基于這些癥狀，懷疑是由小麥矮縮病毒(WDV)所致，并于2007年本實驗室首次報道了WDV在山西省太原麥田的發(fā)生。小麥矮縮病的發(fā)生與寄主小麥、病毒、介體條沙葉蟬等在特定生態(tài)環(huán)境條件下的相互作用有關(guān)。近年來全球氣溫升高現(xiàn)象普遍發(fā)生，導(dǎo)致暖冬出現(xiàn)頻率加大，有利于介體昆蟲的越冬和傳毒，加之缺乏對現(xiàn)在推廣小麥品種抗病性的了解，有關(guān)小麥矮縮病在我國的發(fā)生與危害應(yīng)該予以更大地關(guān)注。