枇杷幼果中定殖的冰核細菌與凍害關系

摘要 從不同地區(qū)和不同海拔果園采集枇杷幼果，分離與測定INA細菌冰核活性，結果表明冰核細菌廣泛分布在不同產區(qū)枇杷幼果，其帶菌率與地理生態(tài)條件有關。高海拔果園幼果帶菌率高達77.5％，且出現(xiàn)冰核活性強的分離菌，海拔愈低其帶菌率相應下降。用2個菌株做人工模擬霜凍和果園接種試驗，結果顯示接種處理明顯加劇凍害，多數(shù)情況嚴重度增50％以上。首次證明INA細菌是誘發(fā)枇杷幼果凍害的重要因素。

關鍵詞 冰核細菌；枇杷幼果；凍害

中圖分類號 S436.67

枇杷是福建省種植面積較大的特色水果，色澤橙黃，柔軟多汁，酸甜可口，風味獨特，富含營養(yǎng)。是一年四季中最早上市的水果，被稱為“報春果”；絕大多數(shù)種植熱帶型品種。

枇杷幼果膨大期正值每年北方寒流頻繁入侵時期，伴隨劇烈降溫。當極端低溫降至一1～-3℃并持續(xù)一定時間時出現(xiàn)凍害，往往幾個小時內毀壞大片果園，給枇杷生產造成重大損失。2004年12月29日起的北方強冷空氣襲擊莆田市，據(jù)統(tǒng)計，枇杷受凍超過1.33萬hm²，產量損失6萬t以上，經濟損失3億多元。

國內外研究證明，自然界中廣泛存在冰核活性細菌(ice nucleation active bacteria，INA細菌)，它可在一1～-3℃下誘發(fā)植物體內細胞水結冰而發(fā)生霜凍。如無INA細菌存在的植物，可耐-6～-7℃的低溫而不發(fā)生或發(fā)生輕微霜凍，說明冰核細菌是加劇植物凍害的重要因素。作者于2005～2007年開展枇杷冰核細菌研究，結果報道如下。

1 材料和方法

1．1 從不同產區(qū)枇杷幼果中分離冰核細菌

于2005～2007年冬春從福建、浙江等省10個枇杷產區(qū)采集幼果，存放在4℃冰箱里。使用時各稱樣品1 g，剪碎研磨，倒入裝有19 mL無菌蒸餾水的三角瓶里，放在150/min下振蕩2 h。從中取0 .1 mL樣液作系列梯度稀釋，分別涂抹在KB平板上，置于20℃下培養(yǎng)72 h后，挑取黃色或白色單菌落，移到斜面上培養(yǎng)48 h。

采用Vali小液滴凍結法測定INA細菌的冰核活性：將斜面上的菌苔用無菌水洗脫后，配成濃度為10⁸cfu/mL的細菌懸液；用微量加樣器吸取0.2 mL滴加到測試表面上，每滴10uL，每處理10滴，重復1次，以無菌水做對照，然后把鋁箔紙漂在盛有酒精的低溫水浴槽上。在-5℃下處理2～3 min后觀察凍結滴數(shù)，凡凍結率達20％以上者，即視為INA細菌，計算1 g標樣所含冰核細菌數(shù)量。

1．2 不同海拔果園枇杷幼果帶菌監(jiān)測

2006年1～2月在莆田市對主栽品種早鐘6號幼果在不同海拔果園取樣調查。低海拔取樣地點為城廂區(qū)華亭鎮(zhèn)，海拔＜150 m；中海拔取樣地點為仙游書峰鎮(zhèn)，海拔150～350 m，高海拔取樣地點為仙游鐘山鎮(zhèn)，海拔＞350 m，各取樣3次，每次每點40粒，分別分離冰核細菌；并對不同細菌懸液稀釋度測定冰核活性.所得活性菌劃分為4個等級(1個冰核中含有的冰核細菌數(shù)量)：特強(10²個)、強(10²～10⁴個)、中(10⁵～10⁶個)、弱(>10個)。

幼果INA帶菌率=帶菌幼果數(shù)/40×100％。

1．3 枇杷幼果接種INA細菌試驗

1．3．1 人工模擬霜凍試驗

選生長良好的掛果袋栽果苗，用歐氏桿菌(Er-winia)(種的分類另見其他發(fā)表文章)2個菌株L₄和L₁₅的細菌懸液，濃度皆為10⁸cfu/mL，分別對幼果噴霧接種，對照苗噴灑清水，試驗前噴灑過2次200單位鏈霉素。接種2 d后連同對照苗一起移入人工氣候室，于-1℃下處理6 h后取出檢查幼果受凍害與否，用刀剖開果實，觀察種子褐變程度。

1．3．2 果園接種試驗

2007年1～2月在福州市晉安區(qū)官溪鎮(zhèn)和福清市一都鎮(zhèn)果場，用2個菌株細菌懸液，每個菌株接種3株，對照區(qū)噴灑清水。

2個果場分別在1月20日和1月29日出現(xiàn)低溫0℃和-2.5℃，凍害發(fā)生后每棵樹冠中層不同方位采果30粒，剖果檢查種子褐變程度。

幼果凍害分級標準：0級為無癥狀；1級為剖開果實，可見部分種子變?yōu)闇\褐色；2級為剖開果實所有種子皆變淺褐色，果肉正常；3級為果實中所有種子皆變深褐色，部分種子敗育；4級為果實中所有種子皆變深褐色，果肉變褐；5級為果實萎縮脫落或掛果。幼果凍害嚴重度=(0.1n₁+0.2n₂+0.5n₃+0.8n₄+1.0ns)/N×100，

n₁，～n₅為各級凍果數(shù)，N為調查總果數(shù)。

2 結果與分析

2．1 冰核細菌在枇杷幼果中的定殖

從福建省莆田、福州、寧德、南平、三明和浙江省德清縣等10個枇杷產區(qū)采集幼果和凍害果中皆分離出冰核細菌(表1)；幼果帶菌密度達10⁴cfu/g以上，說明INA細菌能夠從幼果中獲取養(yǎng)分和水分，得以繼代增殖。

2．2 不同海拔果園枇杷幼果INA細菌帶菌差異

從不同海拔果園采樣分離冰核細菌所得結果(表2)可以看出，幼果中出現(xiàn)的INA細菌頻率高低與不同果園的地理生態(tài)條件有關；依次為：高海拔(77.5％)>中海拔(48.7％)＞低海拔(2.6％)。INA細菌冰核活性強、弱比率也是海拔愈高，出現(xiàn)中、強活性分離菌相應增加。

2．3 枇杷幼果感染冰核細菌經低溫后對凍害的

反應

2．3．1 人工模擬枇杷幼果凍害試驗結果

用2個菌株分別對帶果的袋栽苗接種連同對照苗，經低溫(-1℃持續(xù)6 h)處理后，幼果失綠呈水漬狀，剖開檢查種子褐變程度，所得結果(圖1)顯示，L₄和L₁₅。菌株接種后幼果嚴重度分別為8.9和15.3，對照苗為4.7。與CK相比嚴重度增89.4％和225.5％。

2．3．2 果園枇杷幼果接種INA細菌試驗結果

用2個菌株分別對一都和官溪果場接種后，皆出現(xiàn)極端低溫0℃和-2.5℃。幼果凍害調查結果表明：福清市一都果場L₄和L₁₅。菌株處理，幼果嚴重度為43.5和31.0，對照區(qū)為28.0，兩者相比增55.4％和10.7％。福州晉安區(qū)官溪鎮(zhèn)范郎果場L。和L₁5則為29.8和23.0，對照區(qū)為12.0，兩者相比增148.3％和91.7％。2個不同活性菌株相比，L₄菌株明顯加重幼果凍害。

上述2項試驗盡管幼果接菌皆明顯加重凍害發(fā)生，但有的處理未能達到預期結果，如圖1中強活性菌株L₄誘發(fā)幼果凍害程度不如弱活性的L₁₅菌株，后者在表3中僅比對照增10.7％。可能是尚未摸清不同菌株發(fā)酵條件，搖培菌液冰核活性不穩(wěn)。

3 結論與討論

本研究揭示INA細菌廣泛分布在不同產區(qū)枇杷幼果中，緯度近似其帶菌頻率與果園海拔高度有密切關系，這一結果與凍害發(fā)生不同程度相吻合。高海拔果園枇杷凍害頻繁發(fā)生，如仙游興泰果場地處海拔660 m，近來幼果連年受凍，其凍害率2005年為60％～70％，2006年40％～50％，2007年30％～40％。中海拔果園間歇發(fā)生凍害，低海拔則偶然發(fā)生。但一些群山環(huán)抱的谷地果園，雖然海拔不高，冬末初春強寒流來臨時被山阻擋，冷空氣沉積氣溫驟降，也發(fā)生較高的幼果凍害率，如福清一都果場(表1)。

幼果是枇杷周年中對低溫最敏感的發(fā)育階期，隨著果實發(fā)育膨大耐寒性逐漸提高。通過人工接種試驗表明，冰核細菌明顯加劇幼果凍害，多數(shù)接種處理凍害嚴重度增50％以上。未接種對照皆有不同程度凍害，反映幼果不耐寒，也可能果內自然感染INA細菌的誘發(fā)凍害作用。傳統(tǒng)的霜凍觀點認為是極端低溫對敏感果樹脅迫所致。作者認為枇杷幼果受凍程度由低溫強度、INA細菌多少和果實耐寒性3個因素決定，系低溫條件果內潛伏的冰核細菌對宿主脅迫作用的結果。即冰核細菌誘發(fā)胞內水結冰，導致幼果胚或種子變褐，果面失綠呈水漬狀，并逐漸萎縮干癟脫落。結果展示殺滅冰核細菌，降低胞內水過冷卻點，是避免或減輕枇杷凍害一條新的防霜途徑。