枇杷幼果中定殖的冰核細(xì)菌與凍害關(guān)系

摘要 從不同地區(qū)和不同海拔果園采集枇杷幼果，分離與測(cè)定INA細(xì)菌冰核活性，結(jié)果表明冰核細(xì)菌廣泛分布在不同產(chǎn)區(qū)枇杷幼果，其帶菌率與地理生態(tài)條件有關(guān)。高海拔果園幼果帶菌率高達(dá)77.5％，且出現(xiàn)冰核活性強(qiáng)的分離菌，海拔愈低其帶菌率相應(yīng)下降。用2個(gè)菌株做人工模擬霜凍和果園接種試驗(yàn)，結(jié)果顯示接種處理明顯加劇凍害，多數(shù)情況嚴(yán)重度增50％以上。首次證明INA細(xì)菌是誘發(fā)枇杷幼果凍害的重要因素。

關(guān)鍵詞 冰核細(xì)菌；枇杷幼果；凍害

中圖分類(lèi)號(hào) S436.67

枇杷是福建省種植面積較大的特色水果，色澤橙黃，柔軟多汁，酸甜可口，風(fēng)味獨(dú)特，富含營(yíng)養(yǎng)。是一年四季中最早上市的水果，被稱(chēng)為“報(bào)春果”；絕大多數(shù)種植熱帶型品種。

枇杷幼果膨大期正值每年北方寒流頻繁入侵時(shí)期，伴隨劇烈降溫。當(dāng)極端低溫降至一1～-3℃并持續(xù)一定時(shí)間時(shí)出現(xiàn)凍害，往往幾個(gè)小時(shí)內(nèi)毀壞大片果園，給枇杷生產(chǎn)造成重大損失。2004年12月29日起的北方強(qiáng)冷空氣襲擊莆田市，據(jù)統(tǒng)計(jì)，枇杷受凍超過(guò)1.33萬(wàn)hm²，產(chǎn)量損失6萬(wàn)t以上，經(jīng)濟(jì)損失3億多元。

國(guó)內(nèi)外研究證明，自然界中廣泛存在冰核活性細(xì)菌(ice nucleation active bacteria，INA細(xì)菌)，它可在一1～-3℃下誘發(fā)植物體內(nèi)細(xì)胞水結(jié)冰而發(fā)生霜凍。如無(wú)INA細(xì)菌存在的植物，可耐-6～-7℃的低溫而不發(fā)生或發(fā)生輕微霜凍，說(shuō)明冰核細(xì)菌是加劇植物凍害的重要因素。作者于2005～2007年開(kāi)展枇杷冰核細(xì)菌研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1．1 從不同產(chǎn)區(qū)枇杷幼果中分離冰核細(xì)菌

于2005～2007年冬春從福建、浙江等省10個(gè)枇杷產(chǎn)區(qū)采集幼果，存放在4℃冰箱里。使用時(shí)各稱(chēng)樣品1 g，剪碎研磨，倒入裝有19 mL無(wú)菌蒸餾水的三角瓶里，放在150/min下振蕩2 h。從中取0 .1 mL樣液作系列梯度稀釋?zhuān)謩e涂抹在KB平板上，置于20℃下培養(yǎng)72 h后，挑取黃色或白色單菌落，移到斜面上培養(yǎng)48 h。

采用Vali小液滴凍結(jié)法測(cè)定INA細(xì)菌的冰核活性：將斜面上的菌苔用無(wú)菌水洗脫后，配成濃度為10⁸cfu/mL的細(xì)菌懸液；用微量加樣器吸取0.2 mL滴加到測(cè)試表面上，每滴10uL，每處理10滴，重復(fù)1次，以無(wú)菌水做對(duì)照，然后把鋁箔紙漂在盛有酒精的低溫水浴槽上。在-5℃下處理2～3 min后觀(guān)察凍結(jié)滴數(shù)，凡凍結(jié)率達(dá)20％以上者，即視為INA細(xì)菌，計(jì)算1 g標(biāo)樣所含冰核細(xì)菌數(shù)量。

1．2 不同海拔果園枇杷幼果帶菌監(jiān)測(cè)

2006年1～2月在莆田市對(duì)主栽品種早鐘6號(hào)幼果在不同海拔果園取樣調(diào)查。低海拔取樣地點(diǎn)為城廂區(qū)華亭鎮(zhèn)，海拔＜150 m；中海拔取樣地點(diǎn)為仙游書(shū)峰鎮(zhèn)，海拔150～350 m，高海拔取樣地點(diǎn)為仙游鐘山鎮(zhèn)，海拔＞350 m，各取樣3次，每次每點(diǎn)40粒，分別分離冰核細(xì)菌；并對(duì)不同細(xì)菌懸液稀釋度測(cè)定冰核活性.所得活性菌劃分為4個(gè)等級(jí)(1個(gè)冰核中含有的冰核細(xì)菌數(shù)量)：特強(qiáng)(10²個(gè))、強(qiáng)(10²～10⁴個(gè))、中(10⁵～10⁶個(gè))、弱(>10個(gè))。

幼果INA帶菌率=帶菌幼果數(shù)/40×100％。

1．3 枇杷幼果接種INA細(xì)菌試驗(yàn)

1．3．1 人工模擬霜凍試驗(yàn)

選生長(zhǎng)良好的掛果袋栽果苗，用歐氏桿菌(Er-winia)(種的分類(lèi)另見(jiàn)其他發(fā)表文章)2個(gè)菌株L₄和L₁₅的細(xì)菌懸液，濃度皆為10⁸cfu/mL，分別對(duì)幼果噴霧接種，對(duì)照苗噴灑清水，試驗(yàn)前噴灑過(guò)2次200單位鏈霉素。接種2 d后連同對(duì)照苗一起移入人工氣候室，于-1℃下處理6 h后取出檢查幼果受凍害與否，用刀剖開(kāi)果實(shí)，觀(guān)察種子褐變程度。

1．3．2 果園接種試驗(yàn)

2007年1～2月在福州市晉安區(qū)官溪鎮(zhèn)和福清市一都鎮(zhèn)果場(chǎng)，用2個(gè)菌株細(xì)菌懸液，每個(gè)菌株接種3株，對(duì)照區(qū)噴灑清水。

2個(gè)果場(chǎng)分別在1月20日和1月29日出現(xiàn)低溫0℃和-2.5℃，凍害發(fā)生后每棵樹(shù)冠中層不同方位采果30粒，剖果檢查種子褐變程度。

幼果凍害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為無(wú)癥狀；1級(jí)為剖開(kāi)果實(shí)，可見(jiàn)部分種子變?yōu)闇\褐色；2級(jí)為剖開(kāi)果實(shí)所有種子皆變淺褐色，果肉正常；3級(jí)為果實(shí)中所有種子皆變深褐色，部分種子敗育；4級(jí)為果實(shí)中所有種子皆變深褐色，果肉變褐；5級(jí)為果實(shí)萎縮脫落或掛果。幼果凍害嚴(yán)重度=(0.1n₁+0.2n₂+0.5n₃+0.8n₄+1.0ns)/N×100，

n₁，～n₅為各級(jí)凍果數(shù)，N為調(diào)查總果數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 冰核細(xì)菌在枇杷幼果中的定殖

從福建省莆田、福州、寧德、南平、三明和浙江省德清縣等10個(gè)枇杷產(chǎn)區(qū)采集幼果和凍害果中皆分離出冰核細(xì)菌(表1)；幼果帶菌密度達(dá)10⁴cfu/g以上，說(shuō)明INA細(xì)菌能夠從幼果中獲取養(yǎng)分和水分，得以繼代增殖。

2．2 不同海拔果園枇杷幼果INA細(xì)菌帶菌差異

從不同海拔果園采樣分離冰核細(xì)菌所得結(jié)果(表2)可以看出，幼果中出現(xiàn)的INA細(xì)菌頻率高低與不同果園的地理生態(tài)條件有關(guān)；依次為：高海拔(77.5％)>中海拔(48.7％)＞低海拔(2.6％)。INA細(xì)菌冰核活性強(qiáng)、弱比率也是海拔愈高，出現(xiàn)中、強(qiáng)活性分離菌相應(yīng)增加。

2．3 枇杷幼果感染冰核細(xì)菌經(jīng)低溫后對(duì)凍害的

反應(yīng)

2．3．1 人工模擬枇杷幼果凍害試驗(yàn)結(jié)果

用2個(gè)菌株分別對(duì)帶果的袋栽苗接種連同對(duì)照苗，經(jīng)低溫(-1℃持續(xù)6 h)處理后，幼果失綠呈水漬狀，剖開(kāi)檢查種子褐變程度，所得結(jié)果(圖1)顯示，L₄和L₁₅。菌株接種后幼果嚴(yán)重度分別為8.9和15.3，對(duì)照苗為4.7。與CK相比嚴(yán)重度增89.4％和225.5％。

2．3．2 果園枇杷幼果接種INA細(xì)菌試驗(yàn)結(jié)果

用2個(gè)菌株分別對(duì)一都和官溪果場(chǎng)接種后，皆出現(xiàn)極端低溫0℃和-2.5℃。幼果凍害調(diào)查結(jié)果表明：福清市一都果場(chǎng)L₄和L₁₅。菌株處理，幼果嚴(yán)重度為43.5和31.0，對(duì)照區(qū)為28.0，兩者相比增55.4％和10.7％。福州晉安區(qū)官溪鎮(zhèn)范郎果場(chǎng)L。和L₁5則為29.8和23.0，對(duì)照區(qū)為12.0，兩者相比增148.3％和91.7％。2個(gè)不同活性菌株相比，L₄菌株明顯加重幼果凍害。

上述2項(xiàng)試驗(yàn)盡管幼果接菌皆明顯加重凍害發(fā)生，但有的處理未能達(dá)到預(yù)期結(jié)果，如圖1中強(qiáng)活性菌株L₄誘發(fā)幼果凍害程度不如弱活性的L₁₅菌株，后者在表3中僅比對(duì)照增10.7％。可能是尚未摸清不同菌株發(fā)酵條件，搖培菌液冰核活性不穩(wěn)。

3 結(jié)論與討論

本研究揭示INA細(xì)菌廣泛分布在不同產(chǎn)區(qū)枇杷幼果中，緯度近似其帶菌頻率與果園海拔高度有密切關(guān)系，這一結(jié)果與凍害發(fā)生不同程度相吻合。高海拔果園枇杷凍害頻繁發(fā)生，如仙游興泰果場(chǎng)地處海拔660 m，近來(lái)幼果連年受凍，其凍害率2005年為60％～70％，2006年40％～50％，2007年30％～40％。中海拔果園間歇發(fā)生凍害，低海拔則偶然發(fā)生。但一些群山環(huán)抱的谷地果園，雖然海拔不高，冬末初春強(qiáng)寒流來(lái)臨時(shí)被山阻擋，冷空氣沉積氣溫驟降，也發(fā)生較高的幼果凍害率，如福清一都果場(chǎng)(表1)。

幼果是枇杷周年中對(duì)低溫最敏感的發(fā)育階期，隨著果實(shí)發(fā)育膨大耐寒性逐漸提高。通過(guò)人工接種試驗(yàn)表明，冰核細(xì)菌明顯加劇幼果凍害，多數(shù)接種處理凍害嚴(yán)重度增50％以上。未接種對(duì)照皆有不同程度凍害，反映幼果不耐寒，也可能果內(nèi)自然感染INA細(xì)菌的誘發(fā)凍害作用。傳統(tǒng)的霜凍觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為是極端低溫對(duì)敏感果樹(shù)脅迫所致。作者認(rèn)為枇杷幼果受凍程度由低溫強(qiáng)度、INA細(xì)菌多少和果實(shí)耐寒性3個(gè)因素決定，系低溫條件果內(nèi)潛伏的冰核細(xì)菌對(duì)宿主脅迫作用的結(jié)果。即冰核細(xì)菌誘發(fā)胞內(nèi)水結(jié)冰，導(dǎo)致幼果胚或種子變褐，果面失綠呈水漬狀，并逐漸萎縮干癟脫落。結(jié)果展示殺滅冰核細(xì)菌，降低胞內(nèi)水過(guò)冷卻點(diǎn)，是避免或減輕枇杷凍害一條新的防霜途徑。