苦瓜活性組分物質(zhì)抑菌活性測定

摘要 以苦瓜(Momordica charantia L.)種仁中提取的凝集素備提物和苦瓜籽粗蛋白對8種植物病原真菌，5種植物病原細菌進行了抑菌活性測定。結(jié)果表明：兩種提取物對小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌和蘋果炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。凝集素備提物(0.67 mg/mL)對小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌的抑菌率分別為69.12％和64.86％；苦瓜籽粗蛋白(6.67 mg/mL)對蘋果炭疽病菌的抑菌率達68.61％。兩種提取物對大白菜軟腐病菌、花生青枯病菌、水稻白葉枯病菌和根癌農(nóng)桿病菌等植物病原細菌均無抑菌活性，苦瓜籽粗蛋白(0.1 g/mL)對水稻細條病菌有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞 苦瓜凝集素備提物；苦瓜籽粗蛋白；抑菌活性

中圖分類號 S482.292

苦瓜(Momordica charantia L.)是葫蘆科苦瓜屬一年蔓生草本植物，具有降血糖、抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等多種生物活性。目前，國內(nèi)外對苦瓜的研究多集中在其降血糖功能因子和藥物開發(fā)上，而對其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的抑菌作用研究甚少。由于化學(xué)合成農(nóng)藥易產(chǎn)生嚴重的“三R”問題，天然殺菌劑的研究日益受到重視。當(dāng)今世界新農(nóng)藥開發(fā)的熱點便是從植物中尋找新的殺菌抑菌活性物質(zhì)，研制開發(fā)新型植物源殺菌劑。本試驗擬通過研究苦瓜種子蛋白和凝集素備提物對植物病原菌生長的作用，以期將它們作為一種天然植物抗菌藥物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1．1 供試樣品及制備方法

1．1．1 凝集素備提物的制備

50 g脫脂苦瓜種仁粉，用250 mL含0.15 mol/L NaCl的磷酸緩沖液(5 mmol/L，pH7.2)于4℃提取2次，每次12 h，離心去渣，合并2次上清液加入0.8倍體積冷丙酮，10 000 r/min離心15 min，取沉淀物，冷凍干燥成凝集素備提物凍干粉，保存于-20℃冰箱中備用。

1．1．2 苦瓜籽粗蛋白的制備

稱取脫脂苦瓜種仁粉，加10倍50mmol/L的硼酸鈉緩沖液(pH8.2)，在4℃提取48 h。提取液經(jīng)10 000 r/min離心15 min，取上清液加(NH₄)₂SO₄至80％飽和度，在4℃攪拌3 h，經(jīng)10 000 r/min離心15 min后得到沉淀。沉淀物冷凍干燥后即得苦瓜籽粗蛋白制劑，保存于-20℃冰箱中備用。

1．2 供試菌種

本試驗供試菌種由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系植物病理學(xué)實驗室提供。

供試植物病原真菌為棉花立枯病菌(Rhizocto-nia Kuhn.)、玉米小斑病菌[Bipolaris maydis(Nisik b-Miyake)Shoem.]、棉花紅腐病菌(Fusari-um moniliforme Sheld)、蘋果炭疽病菌[Colletotri-chum gloeosporioides(Penz.)Penz.Sacc.]、花生白絹病菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)、大麥條紋病菌[Drechslera graminea (Rab.Schlecht.)Shoem.]、小麥赤霉病菌[Gibberella zeae(Schw.)Petch]、棉花黃萎病菌(Verticillium albo-atrumReinke et Berth)。

供試植物病原細菌為大白菜軟腐病菌[Erwiniaaroideae(Towns.)]、花生青枯病菌(Pseudomonassolanacearum Smith)、水稻白葉枯病菌[Xan-thomonas compestris pv.oryzae(Ishiyama)Dye]、水稻細條病菌[Xanthomonas campestris pv.oryzi-cola(Fang et a1)Dye]、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens Biova)。

1．3 培養(yǎng)基

植物病原真菌使用PDA培養(yǎng)基，植物病原細菌使用LB培養(yǎng)基。

1．4 植物病原真菌細菌的抑菌活性測定

1．4．1 植物病原真菌的處理

采用生長速率法測定供試樣品對真菌的抑制作用，具體做法如下：用250 mL三角瓶分裝PDA培養(yǎng)基，滅菌后備用。將8種供試植物病原真菌分別轉(zhuǎn)平板后，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，待菌絲滿后，用滅菌的打孔器(d=6 mm)將長滿菌絲的平板分為一系列帶菌瓊脂塊，備用。

精確稱取各供試樣品，用無菌水將凝集素備提物稀釋成100倍的溶液，將苦瓜籽粗蛋白分別稀釋成10、20、40倍的溶液，待供試樣品充分溶解后，分別取上述不同稀釋度溶液1 mL與14 mL的PDA培養(yǎng)基混合均勻制成終濃度分別是0.67、6.7、3.3和1.67 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，倒入直徑為9 cm平板中。待平板凝固后，將帶菌的瓊脂塊分別接入各平板中央。凝集素備提物設(shè)1個處理，苦瓜籽粗蛋白設(shè)3個處理，空白對照(清水)和每個處理各設(shè)3個重復(fù)。放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于48 h和72 h觀察記錄對照和供試樣品處理的平板菌落直徑生長情況，計算各供試樣品對各供試植物病原真菌的抑菌率。

1．4．2 植物病原細菌的處理

采用平板混菌法。具體做法如下：在滅菌的小三角瓶中加入1 mL無菌水，將活化的細菌用接種環(huán)挑取少量，混入50 mL小三角瓶中(瓶中加入滅菌的小玻璃珠)，充分搖勻，計數(shù)(10⁷cfu/mL)備用。用250 mL三角瓶分裝LB培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至45℃左右備用。取已混勻的菌液和培養(yǎng)基按1:15比例混勻，迅速倒平板。將滅菌的直徑為6 mm的濾紙片兩層疊加在一起放在凝固后的平板上，然后用移液器分別滴加10 uL的0.1 g/mL凝集素備提物和苦瓜籽粗蛋白溶液。空白對照(清水)和每個處理各設(shè)3個重復(fù)。放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于48 h和72 h觀察記錄其生長情況。

1．5 試驗數(shù)據(jù)處理

抑菌率＝(對照組病原菌落直徑－處理組病原菌落直徑)/對照組病原菌落直徑×100％。

2 結(jié)果與分析

2．1 植物病原真菌的抑菌活性測定

2．1．1 凝集素備提物對植物病原真菌的抑菌活性測定

采用生長速率法測定了苦瓜種仁凝集素備提物對棉花立枯病菌、玉米小斑病菌、棉花紅腐病菌、蘋果炭疽病菌、花生白絹病菌、大麥條紋病菌、小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果詳見表1。

由表1可知，苦瓜種仁凝集素備提物對小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌均表現(xiàn)出較好的抑菌活性，在0.67 mg/ml 理濃度下48、72 h的抑菌率分別為49.79％、41.38％和69.12％、64.86％；對棉花立枯病菌和玉米小斑病菌的抑菌活性次之，在0.67 mg/mL處理濃度下48、72 h的抑菌率分別為35.47％、33.07％和32.35％、42.13％；對棉花紅腐病菌、蘋果炭疽病菌和大麥條紋病菌均表現(xiàn)出很弱的抑制活性，僅棉花紅腐病菌在72 h的抑菌率達到了20.16％，其他的在48 h和72 h的抑菌率都在20.00％以下；對花生白絹病菌非但沒有抑制活性，反而有促進菌絲生長作用。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示0.67 mg/mL處理濃度下凝集素備提物對8種植物病原真菌的抑菌效果存在差異，以小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌的抑菌效果最好。以上結(jié)果表明：對同一種病原真菌而言，除花生白絹病菌促進菌絲生長以外，棉花立枯病菌和蘋果炭疽病菌的抑菌率72 h低于48 h，而其他5種植物病原真菌，隨處理時間的延長，抑菌率呈上升趨勢。

2．1．2 苦瓜籽粗蛋白對植物病原真菌的抑菌活性

測定

采用生長速率法測定了苦瓜籽粗蛋白對棉花立枯病菌、玉米小斑病菌、棉花紅腐病菌、蘋果炭疽病菌、花生白絹病菌、大麥條紋病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果詳見表2。

由表2可知，對于同一種植物病原真菌而言，抑菌率隨處理濃度的降低而下降；同一濃度處理時，隨著時間的延長，玉米小斑病菌、棉花紅腐病菌和大麥條紋病菌的抑菌率均升高，而蘋果炭疽病菌和花生白絹病菌的抑菌率則呈下降趨勢。

由表2可知，6.67 mg/mL最高濃度處理的苦瓜籽粗蛋白對蘋果炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，48、72 h的抑菌率分別為69.87％和68.61％；對花生白絹病菌和玉米小斑病菌的抑菌活性次之，48、72 h的抑菌率分別為58.62％、51.06％和49.00％、53.39％；對大麥條紋病菌表現(xiàn)出非常弱的抑制活性，48、72 h的抑菌率分別只有5.80％和14.04％。對棉花立枯病菌非但沒有抑菌活性，反而表現(xiàn)出一定的促進菌絲生長作用。當(dāng)處理濃度低于6.67 mg/mL時，苦瓜籽粗蛋白對大麥條紋病菌也表現(xiàn)為促進生長作用。

2.2 植物病原細菌的抑菌活性測定

經(jīng)抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)0.1 g/mL濃度處理的凝集素備提物對5種供試植物病原細菌均無抑制生長作用。0.1、0.05 g/mL和0.025 g/mL濃度處理的苦瓜籽粗蛋白對大白菜軟腐病菌、花生青枯病菌、水稻白葉枯病菌和根癌農(nóng)桿病菌也均無抑制作用。對水稻細條病菌的抑菌活性測定中發(fā)現(xiàn)，在苦瓜籽粗蛋白的最高濃度(0.1 g/mL)處理下，72 h后濾紙片周圍有光亮的抑菌圈出現(xiàn)，而0.05和0.025 g/mL濃度處理均未發(fā)現(xiàn)有抑制作用。

3 討論

抑菌活性測定表明，0.67 mg/mL濃度處理的凝集素備提物對供試植物病原真菌中的7種均存在一定的抑菌活性。72 h時，對小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌的抑制活性較好，最高抑菌率分別為69.12％和64.86％；對玉米小斑病菌和棉花立枯病菌的抑菌活性次之，最高抑菌率分別為42.13％和32.35％；對棉花紅腐病菌、大麥條紋病菌和蘋果炭疽病菌表現(xiàn)出弱抑菌活性，最高抑菌率分別為20.16 9/6、10.60％和4.17％；對花生白絹病菌則具有促進菌絲生長的作用。由此得出抑菌作用效果從高到低依次為：小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌＞玉米小斑病菌、棉花立枯病菌＞棉花紅腐病菌、大麥條紋病菌、蘋果炭疽病菌。

苦瓜籽粗蛋白對供試植物病原真菌中的蘋果炭疽病菌、玉米小斑病菌、花生白絹病菌和棉花紅腐病菌4種真菌均存在一定的抑菌活性，6.67 mg/mL濃度處理下的72 h抑菌率分別為68.61％、53.39％、51.06％和14.25％，抑菌作用效果依次為：蘋果炭疽病菌＞玉米小斑病菌、花生白絹病菌＞棉花紅腐病菌；對棉花立枯病菌表現(xiàn)為促進其菌絲生長作用；對大麥條紋病菌的抑菌活性測定中發(fā)現(xiàn)，濃度6.67 mg/mL苦瓜籽粗蛋白對其表現(xiàn)出弱抑制活性，但3.33、1.67 mg/mL濃度處理下，則表現(xiàn)為促進菌絲生長的作用。說明在這兩濃度之間可能存在一個濃度臨界點，在臨界點之上表現(xiàn)抑制作用，臨界點之下則表現(xiàn)促進作用。

試驗結(jié)果表明，一種抑菌劑的抑菌效果一般與使用濃度有關(guān)，如苦瓜籽粗蛋白在6.67 mg/mL最高濃度處理下對蘋果炭疽病菌的抑菌率為68.61％，在1.67 mg/mL最低濃度處理下抑菌率則為36.97％。但也可在不同的濃度范圍內(nèi)分別表現(xiàn)出抑制生長和促進生長兩種完全不同的反應(yīng)，如苦瓜籽粗蛋白對大麥條紋病菌在6.67 mg/mL濃度處理下的抑菌率為5.80％，在3.33和1.67 mg/mL濃度處理下則表現(xiàn)為促進菌絲生長的作用。在低濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出的促進生長反應(yīng)，可能是由于這種物質(zhì)在低濃度時會刺激菌絲增殖，也可能是由于它可以為該種病原真菌提供營養(yǎng)成分，從而導(dǎo)致其生長加速。

本試驗僅以苦瓜種仁凝集素備提物和苦瓜籽粗蛋白對8種植物病原真菌和5種植物病原細菌進行了抑菌活性測定。結(jié)果表明，兩種提取物對小麥赤霉病菌、棉花黃萎病菌和蘋果炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的其他重要的植物病原真菌和細菌以及動物細菌，這兩種提取物以及苦瓜其他的活性組分物質(zhì)是否同樣具有抑菌活性，有待于進一步研究和篩選，以建立一個系統(tǒng)的抑菌譜，從而擴展苦瓜活性組分物質(zhì)作為農(nóng)用、醫(yī)用殺菌劑的應(yīng)用范圍和前景。