茶云紋葉枯病病原菌侵入與葉位關系研究

摘要 采用茶園調查和室內接種相結合的方法，研究了茶云紋葉枯病病菌(Colletotrichum carnelliae)侵入與不同葉位的關系。結果表明：自然狀態(tài)下，病害癥狀主要出現在成、老葉上。2006年嫩葉組、成葉組和老葉組3處理的病葉率分別為0.89％、18.89％、10.67％，2007年分別為2.00％、19.56％、13.78％，其中嫩葉、成葉上的病害都是當年病菌侵染所致。茶枝離體接種時，癥狀出現在嫩葉和成葉上，而且以前者為多，2006年3處理的病葉率分別為15.28％、9.73％和O％，2007年分別為12.50％、8.73％和2.78％。結果顯示：分生孢子的侵染葉位以嫩葉為主，在各類葉片上均有較高的萌發(fā)率，但只有部分能夠形成附著胞，在嫩葉和成葉上形成率較高，老葉上幾乎不能形成。不同葉位的解剖結構如角質層厚薄、柵欄組織層次多少、海綿組織細胞排列松緊等都與病菌侵染有一定的相關性。

關鍵詞 茶云紋葉枯病；分生孢子；附著胞；發(fā)病率；病情指數

中圖分類號 S435.711

茶云紋葉枯病是茶樹上最常見的葉部病害之一，分布很廣，一些主要產茶國如日本、印度、斯里蘭卡等均有報道，國內各產茶省(自治區(qū))均有發(fā)生。田間癥狀主要出現在成葉和老葉部位，病部出現灰白相間的云紋狀病斑，病健分界較明顯。成、老葉上的病斑很大，可擴展至葉片總面積的3/4，嚴重時會出現大量的落葉。近些年來，合肥周邊茶區(qū)該病的發(fā)生有逐年加重的趨勢，對茶葉生產的影響也越來越大，必須引起高度重視。本試驗立足于探索茶樹不同葉位與病葉率的關系和病原菌的侵染過程，旨在為病害的綜合治理，特別是選擇最佳防治時期提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 茶園病情調查

2006年和2007年連續(xù)兩年對該病在自然狀態(tài)下茶樹不同葉位的發(fā)病情況進行了隨機抽樣調查。設嫩葉組(1芽1葉～1芽3葉)、成葉組和老葉組3個處理，每處理3次重復。每重復調查150片葉，即1個處理調查450片葉。采用平行線取樣法。記載病葉數和病級，并計算病葉率和病情指數。病斑分級按高旭暉分級法。

1．2 室內接種處理

兩年的室內接種均在5月中旬進行。Collecto-trichurn cameliae菌種來自本校實驗茶園，用PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，并配制成孢子懸浮液，濃度為3.49×10⁶個/mL。配制插枝營養(yǎng)液(成分略)。在茶園剪取33 cm的健壯無病的枝條(福鼎)，每廣口瓶插4枝，每3瓶為1重復，每處理重復3次。用喉頭噴霧器在室內接種，保濕24 h后，在室溫下培養(yǎng)。接菌后的溫度白天均在22℃以上，夜晚在18℃以上，定時噴霧保濕，晴天保持不少于5 h的光照。除濕度較高外，其他基本上接近自然狀態(tài)下的氣候條件。同樣設嫩葉組、成葉組和老葉組3個處理，對枝條上所有葉片都均勻接種，7 d后檢查各處理的發(fā)病情況，嫩葉組和成葉組檢查72片葉，老葉組檢查36片葉(老葉在枝條上少)，并統計病葉率。

1．3 接種后病原菌動態(tài)觀察

選取各處理的葉片共27片，每個處理9片，分別放在9個墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙中浸有無菌水，3片/皿，每處理3皿，葉片經無菌水沖洗后放入培養(yǎng)皿。以上述濃度的孢子懸浮液接種，放入22。C下恒溫培養(yǎng)。接種后48 h，在各處理中取1片葉，切取4 mm×3 mm的小塊病組織，以苯胺藍乳酚液作浮載劑，檢查各處理葉片上平均每視野內的孢子數(取9個視野內的平均數)，逐日顯微鏡下檢查孢子萌發(fā)情況，計算孢子的萌發(fā)率和附著胞的形成率，并注意菌絲的侵入過程。

1．4 接種后葉片的結構剖析

接種后7 d檢查發(fā)病情況，記載各處理的病葉率，顯微鏡檢各處理葉片葉背茸毛、氣孔密度。每葉在葉尖或葉緣、中部和后部切取3塊葉組織(3 mm×2 mm)，各處理檢查9片葉，切下的葉塊在卡諾氏液中過夜固定后，再放在滴有乳酸苯酚苯胺藍的玻片上，處理后的葉組織置于顯微鏡下計數，取27個視野的平均值，并切片檢查其角質層的厚薄、柵欄組織的層次、海綿組織細胞排列的松緊等等，看這些結構因子與病情之間有無內在的聯系。

2 結果與分析

2．1 茶園病情調查

連續(xù)兩年茶園病情調查結果見表1。

表中的數據可以看出：茶云紋葉枯病在茶園冠層層面上發(fā)病率很低，嫩葉組的病葉率分別為0.89％、2.00％，而在當年生的成葉上的病葉率和病情指數最高，在頭年生的老葉上也出現了較高的病葉率和病情指數，這些老葉病斑上的子實體往往就是當年病害的初侵染源，在一定程度上影響著當年的病情。以LSR法對病葉率進行多重比較，各處理間均達到了極顯著水平。成葉和嫩葉間達極顯著水平，說明當年分生孢子侵入并引起發(fā)病的主要在成葉上；成葉和老葉間達極顯著水平，說明當年罹病成葉脫落較多，老葉上的病斑僅作為翌年病害發(fā)生的初侵染源。從兩年的調查結果來看，在合肥地區(qū)，2007年茶云紋葉枯病略重于2006年，雖然兩年均屬于中度偏輕發(fā)生年份，但從老葉組積累的病葉來看，病原菌有逐年增多的趨勢，應引起足夠的重視。

2．2 室內接種試驗

插枝接種試驗結果如表2。

表2數據顯示，室內接種病情與茶園自然狀態(tài)下的病情有較大的區(qū)別，前者在嫩葉組處理發(fā)病率最高，兩年分別為15％和12％；成葉組次之，不到10％；老葉組很少發(fā)病。病葉率經LSR法多重比較，嫩葉組和成葉組間達極顯著水平，說明嫩葉是分生孢子最易侵染的葉位，其次才是成葉；成葉與老葉間、嫩葉與老葉間的差異也分別達極顯著水平，該病菌的分生孢子不能侵染老葉。病菌侵染葉片一是要靠孢子萌發(fā)時對葉片形成的機械壓力，二是要靠孢子在侵染過程中分泌一些酶的作用，如角質分解酶、纖維素分解酶等，在機械壓力和酶的共同作用下，孢子才能成功地侵染茶樹。老葉的角質層和柵欄組織已完全形成，病菌很難突破其阻力來實現侵染。即不同葉位的結構因子的差異可引起病葉率的不同，除此之外，還可能與不同葉位細胞內的生化成分有關。

2．3 病原菌侵染的動態(tài)觀察

分生孢子接種到葉片上其萌發(fā)動態(tài)如表3。

病原菌分生孢子在人工接種條件下，葉片表面的密度相當高，經顯微鏡檢平均每個視野的孢子都在10個以上，而這些孢子經人工保濕和22℃的恒溫培養(yǎng)，其萌發(fā)率也只維持在60％～80％之間，并不是每一個孢子都能萌發(fā)；而能形成附著胞的很少，其在嫩葉組和成葉組分別為23.08％和27.27％。真正能夠成功地實現侵染，致使葉片形成病斑的就更少了，所以，病葉率要遠低于孢子的萌發(fā)率和附著胞的形成率(表2、表3)。附著胞形成率經LSR法多重比較，成葉和嫩葉間差異不顯著，說明分生孢子在成葉和嫩葉上均能較好的萌發(fā)和形成附著胞；成葉與老葉間、嫩葉與老葉間的差異均達到極顯著水平。據試驗觀察，落于嫩葉和成葉上的部分分生孢子，很快萌發(fā)，并形成附著胞，侵入細胞組織內，以菌絲穿行于細胞間。特別是在嫩葉組織問、菌絲分支速度較快，接種后5 d，密布呈網狀；菌絲在成葉組織細胞間較稀疏，伸展速度也相對較慢。所以，離體茶枝接種時，嫩葉上的病葉率遠高于成葉上，差異達極顯著水平，這可能與兩類葉片內部的抗性物質濃度有關；孢子在老葉的表面雖然可以萌發(fā)，但很少能形成附著胞，幾乎不能實現侵染，除了與老葉的結構抗性有關外，還可能與葉表分泌物的種類和濃度有關。

2．4 葉片結構與病葉率間的關系

不同生態(tài)位葉片在結構上有所區(qū)別，它們對病菌實現侵染都具有一定的影響，最后導致病葉率的差異，結果見表4。

葉片解剖結果顯示：病葉率與角質層厚薄，柵欄組織層次多少，海綿組織細胞排列松緊的關系較密切，特別是與角質層的厚薄、柵欄組織層次多少直接相關。室內接種試驗表明，茶云紋葉枯病分生孢子在嫩葉上的侵染率遠高于在成葉上。這可能與嫩葉上角質層較薄、柵欄組織沒有完全形成等結構因子有關。當然，與嫩葉中某些營養(yǎng)成分和抗性物質的種類及濃度也有一定的關系，如游離氨基酸和多酚物質的相對含量等。需要指出的是，下部老葉的發(fā)病率很低，5月中旬調查老葉上的病斑基本上都是上一年遺留下來的病葉。

3 討論

3．1 癥狀出現的葉位

室內人工接種顯示，分生孢子在嫩葉和成葉上均能萌發(fā)，形成附著胞，以菌絲侵入到葉片組織細胞間，直至癥狀出現，而且，在嫩葉上更容易實現侵染。這與茶園內出現的情況很不一致。在自然狀態(tài)下，茶云紋葉枯病癥狀主要出現在成葉上。落在嫩葉葉表的分生孢子從萌發(fā)到有明顯癥狀(灰白色小斑)出現往往需要15 d左右，而此時的嫩葉亦已變?yōu)槌扇~了。嫩葉的定期采摘使得一些侵入的病菌還處在潛育期就被摘下了，未來得及表現癥狀。實驗室內接種能基本滿足分生孢子理想的侵入條件，而剪下的茶枝又停止生長，抗病性也相對降低，且葉片上一出現褐點狀的病斑就被發(fā)現，一般僅需7 d左右，所以，癥狀出現在嫩葉上多。當然，離體茶枝成葉上出現的癥狀是接種在成葉葉片上的分生孢子侵入所致，與嫩葉無關。

3．2 老葉上的癥狀

經多年的觀察，茶園中老葉上出現的病斑，病級較高，一般都在3～4級，這些病葉在深秋和嚴冬季節(jié)大多脫落，只有少數可以越冬，而成為翌年發(fā)病的初侵染源。2007年在室內離體接種的插枝上發(fā)現1片病葉，這可能是在剪枝時沒有注意，從茶園帶入的，不是在實驗室侵染所致。經初步試驗觀察，分生孢子在老葉上雖然能較好地萌發(fā)，但不能形成附著胞，所以，不能侵染老葉，茶園中老葉上的病斑一般都是由成葉上病斑遺留下來的。

3．3 綜合治理

根據試驗結果和病原菌的生物學特性，結合當前的無公害茶葉生產考慮，對于該病的防治應采用控制病原菌為主的措施。最好在深秋除去茶樹老葉中的病葉，并清理茶園中的落葉，旨在控制越冬菌源。春季的定期采摘對控制該病的流行具有明顯的作用。病害特別嚴重的茶園可在深秋封園時，在采用上述措施的基礎上，每隔2～3年噴1次石硫合劑或波爾多液。