青枯菌無致病力菌株對煙草青枯病的控病作用初步研究

摘要 從茄子、番茄、辣椒、煙草青枯病株中分離出116株無致病力青枯菌，室內平板噴霧法拮抗試驗結果表明，有21株菌在NA培養基上可明顯抑制青枯菌TbRs的生長；煙草MSK326品種溫室盆栽控病試驗表明，Tmjdl-3和Aujd8-2-1兩株菌具有較好控病效果，20 d后的相對防效分別為58.4％和97％。

關鍵詞 煙草；青枯病菌；無致病力菌株；防效

中圖分類號 S435.72：S476.1

煙草青枯病是由勞爾氏菌屬的茄假單胞桿菌(Ralstonia solanacearum)引起的熱帶、亞熱帶地區煙草的重要病害，是一種典型的維管束病害，一旦發病即可造成全株死亡，對煙草的產量和質量影響極大，是煙草上一大毀滅性病害。目前對煙草青枯病的防治，仍無十分有效的措施。生物防治具有無公害、無環境污染和防治作用專化性等優點，Okabe在1954年首次發現青枯菌株之間有拮抗作用后，國內外許多學者開展了利用無致病力青枯菌防治植物青枯病的研究工作。A.Trigalet等發現誘變產生的無致病力青枯菌突變株GMll229能在番茄莖、葉部定殖，可阻止致病菌的增殖，并表現有一定誘導抗性，具有較好的生物防治前景。陳慶河用紫外誘變法獲得兩株無致病力菌株，研究發現這兩株菌也能在番茄體內定殖，經盆栽試驗表明，20 d后對番茄青枯病防效可達50％以上。本文探索了從4種茄科植物上分離得到的無致病力青枯菌株對煙草青枯病的生防潛能。

1 材料與方法

1．1 供試材料

試驗煙草品種MSK326，由云南省煙草科學研究所提供。指示菌TbRs為青枯強致病菌株，由本實驗室提供。固體培養基為NA，致病性測定培養基為TTC，液體培養基為NB，配方詳見《植病研究方法》第3版。

1．2 青枯菌的采集和分離

在重慶北碚區，江津市，涪陵縣等地采集番茄、茄、辣椒、煙草青枯病病株。

兩種分離方法，具體參照文獻[7]。青枯致病菌株和無致病力菌株的區別參照方中達的方法[6]。純化后，將長出的單菌落用移植環蘸取放入盛有無菌水的試管，采用比濁法使菌懸液的濃度達到3×10⁸cfu/mL，加塞放于25℃條件下保存。

1．3 無致病力菌株的鑒定

通過鞭毛染色鑒定，準備干凈光滑無痕紋的載玻片，用新鮮制備的NA培養基活化菌株，制備染劑，18～24 h進行鞭毛染色并鏡檢。

1．4 平板篩選試驗

初篩：采用噴霧法，將指示菌TbRs涂在NA平板上擴大培養，次日將獲得的無致病力菌株接種到NA平板上活化，然后每皿接菌3～4位點，2次重復，培養6 h后，將已培養好的指示菌配成3×10⁸cfu/mL菌懸液，裝入無菌的喉頭噴霧器中，將其均勻的噴在點接了待測菌的平板上，每皿噴霧約0.2 mL，28℃培養，48 h后觀察是否有抑菌圈形成，并記錄觀察結果。

復篩：方法與初篩相同，將初篩時有抑菌圈的菌種接種到NA平板的中心位置，每個菌株3次重復，方法同初篩，48 h后采用十字交叉法測量抑菌帶寬，并記錄測量結果。

含菌培養基法：將復篩出的抑菌帶寬≥1 cm的菌株采用噴霧法與含菌培養基法進行平板篩選比較。噴霧法同初篩。將指示菌TbRs及待測菌株轉移到NA平板上活化，并擴大培養，TbRs配成3×10⁸cfu/mL的菌懸液，與約45℃的NA培養基按1:10混合，1 h后在平板中心接入待測菌株，每個菌株3次重復，28℃培養，48 h后測量抑菌帶寬，方法同復篩，并記錄測量結果。

1．5 溫室盆栽控病試驗

初測口]：將平板抑菌效果較好的菌株在NA平板上活化并擴大培養，配成3×10⁸cfu/mL菌懸液，把2～3片葉齡的煙草苗從土壤中撥出，洗凈根部土壤，分別浸泡在相應的菌懸液中，對照浸水，浸泡2 h，每處理12株，然后移栽到塑料缽。15 d后傷根灌接活性菌株發酵液，濃度調整為3×10⁸cfu/mL，每株苗灌5 mL，48 h后再灌1次，48 h后同法接種指示菌TbRs菌懸液，設置3個對照，CK空灌無菌水，CK_rs。灌指示菌，CK_x灌待測菌株發酵液。放于28℃的溫室中，在接種后3 d開始觀察并記錄結果。

復測：將初測防治效果好的菌株進行復測。方法與初測類似，煙草苗菌懸液浸根后移栽，每處理10株，3次重復。待煙苗生長20 d后，傷根灌接復測菌株發酵液，每株5 mL，5 d后再灌1次，第2次處理48 h后，同法接種指示菌TbRs，放于28℃的溫室中，出現病株后連續觀察，并記錄結果。

病情分級標準為：0級為無癥狀；1級為植株開始出現萎蔫癥狀，莖部出現短條黑斑；2級為植物50％的葉片萎蔫，莖部有較大黑斑；3級為煙株葉片除頂葉2～3片葉外，全部萎蔫，莖部黑斑長而寬；4級為全株葉片萎蔫，莖大部變黑。

2 結果與分析

2．1 無致病力菌株鑒定結果

鏡檢觀察結果表明(圖1)，試驗中篩選出菌株菌體短桿狀，兩端鈍圓，單極鞭毛1～3根，與青枯菌菌體形態描述相符。

2．2 無致病力菌株平板篩選結果

據方中達的方法區分青枯致病菌株和無致病力菌株，從采集的184份樣本上直接分離得到菌株138株，其中無致病力菌株116株，致病菌株22株，將無致病力菌株進行平板篩選，得到對指示菌有抑菌活性的菌株共63株。抑菌帶寬＞1 cm的菌株21株，抑菌帶寬最大是TbW1-7-1為1.45 cm，Tmidl-3為1.38 cm，Aujd8-2-1為1.37 cm；抑菌帶寬在0.5～1 cm的菌株12株，抑菌帶寬＜0.5 cm的菌株30株如表1。將抑菌帶寬＞1 cm的菌株Tmjdl-3采用噴霧法和含菌培養基兩種篩選方法比較，結果如圖2。對于同一個菌株，采用噴霧法得到的抑菌帶寬普遍大于含菌培養基法得到的，只有Tmt3-2-1、TbYYk1-1兩個菌株是例外，說明這兩個菌株對指示菌可能具有溶菌作用。從圖3看出，噴霧法中部分菌株的抑菌帶寬小于1 cm，與第1次復篩的結果不一致，它們是Au004-2、A ujd5-2、TbYYk1-1、TbW2-3、TbW1-7-1，說明這些菌株的抑菌活性不穩定性，抑菌作用開始衰退(圖3)。

2．3 溫室控病試驗結果

將抑菌帶寬＞1cm的菌株(21株)進行溫室控病試驗，在初次測定的結果中，測定的大部分菌株能夠推遲7 d左右發病，CK_x只灌接待測菌株的煙草苗未表現異常。測定結果如表2。20 d后16株的相對防效均大于60％，其中Au004-1、Aujd8-2-1、Tmjdl-3、L6-3、TbYYk1-1的相對防效大于80％，1株的相對防效為40％～60％，只有4株的相對防效小于40％。根據菌株在NA培養基上的生長勢及溫室控病試驗初測結果，將T mjdl-3、A ujd8-2-1兩個菌株進行溫室控病復測，結果如表3。20 d后Tmjd1-3對煙草青枯病的相對防效為58.4％，Au-jd8-2-1的為97％。

3 討論

比較以前學者在單一寄主上篩選，從198株中篩選到防效較好的2株菌，本試驗采用青枯菌不同寄主分離篩選對煙草青枯菌有防效的無致病力菌株，從116株中篩到2株理想菌，相對比較容易獲得理想菌株，原因可能是來自不同寄主的無致病力菌株，與原寄主在協同進化過程中，產生了相關物質，而這些物質對煙草青枯菌可能具有更強的抑制作用。試驗中對平板篩選出的抑菌效果較好的菌株進行了兩種平板篩選方法的比較，噴霧法抑菌帶寬普遍大于含菌培養基法。究其原因，可能主要由于噴霧法先接種活性菌，有利于抑制煙草青枯菌的活性物質的產生和積累，而含菌培養基法同時接種活性菌及煙草青枯菌，活性物質的產生和積累比噴霧法相對滯后。有兩個菌株的情況相反，說明它們對煙草青枯菌可能還具有溶菌作用。通過兩種方法的比較，作者認為，噴霧法比含菌培養基法操作簡便，快捷，適用于平板篩選試驗。建議可在溫室控病試驗后，再對最終篩選出防效較好的菌株進行含菌培養基法等相關平板抑菌試驗，以便為探討活性菌株的控病作用機制提供更多依據。

試驗結果表明，對煙草青枯菌平板抑菌作用強的菌株，溫室控病效果不一定好，Tbw1-7-1的平板抑菌作用最強，但是溫室控病效果不理想，初測7 d后相對防效為50％，20 d后無防效。Tmjd1-3和Aujd8-2-1平板抑菌作用幾乎無差別，但是溫室控病作用差異大，說明無致病力菌株對煙草青枯菌的平板抑菌作用強弱與溫室控病效果好壞不存在正相關，這與前人研究的結果相同。說明無致病力菌株對煙草青枯菌的控病作用，除了與菌株本身產生的抑菌活性物質相關外，還與菌株是否能在寄主上定殖，與致病菌位點競爭能力以及是否誘導寄主抗性等因素相聯系。本試驗中篩選出溫室控病防效較好的菌株，對于其具體的控病作用機制，以及其他無體外抑菌活性的菌株，不排除它們同樣具有較好防效的可能性，這些問題有待以后的進一步研究。