實時熒光ＲＴ－ＰＣＲ檢測辣椒輕斑駁病毒的初步研究

摘要 本研究選取辣椒輕斑駁病毒PMMoV、煙草花葉病毒TMV、黃瓜花葉病毒CMV和馬鈴薯Y病毒PVY作為試驗材料，根據PMMoV衣殼蛋白(CP)RNA的序列特異性位點，設計出Taqman熒光探針及其引物，采用實時熒光RT-PCR技術對PMMoV進行快速檢測，同時與ELISA方法進行了靈敏度比較，結果表明：該方法具有較高的靈敏度及較強的特異性，PMMoV檢測結果為陽性，TMV、CMV和PVY均無熒光信號，為陰性，靈敏度是傳統的ELISA方法的100倍，而且大大縮短了檢測時間。該方法快速、準確、靈敏、簡便、安全，具有實際應用價值，適用于植物病毒病害的快速檢測。

關鍵詞 辣椒輕斑駁病毒；實時熒光RT-PCR；雙抗夾心酶聯免疫吸附法

中圖分類號 S436.418.12

甜(辣)椒(Capsicum sp．)廣泛栽培于世界各地，是重要的蔬菜之一。辣椒輕斑駁病毒(Peppermild mottle virus，PMMoV)是甜椒上一種危害嚴重的病毒，PMMoV在很多國家都有報道。在美國、日本、英國等國家，該病造成感病辣椒葉片褪綠，果實小、斑駁和畸形，早期發病植株嚴重矮化等癥狀，在英國、日本保護地和美國一些地區辣椒上曾造成毀滅性危害。PMMoV屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，病毒粒子桿狀，為單組分正單鏈RNA病毒(+ssRNA)，編碼4個蛋白，即與病毒復制有關的126kDa、183kDa蛋白、移動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)。該病毒可以種傳和汁液摩擦傳毒，介體不易傳毒，帶毒種子和感病植株是重要的侵染源。在我國該病毒少有報道，1994年向本春首次報道新疆辣椒上發現了辣椒輕斑駁病毒，譚根堂等在2003年報道了陜西線辣椒上病毒病優勢毒原是PMMoV、CMV、蠶豆萎蔫病毒(BBWV)；2003年李明福等報道了引進的一辣椒新品種由于辣椒輕斑駁病毒在種植棚內暴發嚴重病害；2004年黃粵等用RT—PCR方法在山東青島檢測到辣椒輕斑駁病毒；2005年李興紅等報道在北京、寧夏兩地田間甜椒上檢測到辣椒輕斑駁病毒。2005年陳青等在進境辣椒種子中檢出辣椒輕斑駁病毒。

病毒可以存活于種子的種皮、胚或胚乳內，有統計表明約10％的植物病毒被認為是可以通過種子傳播的。病毒隨感染的種子遠距離調運傳播，造成嚴重的經濟損失。目前文獻報道用于檢測辣椒輕斑駁病毒的方法有：電鏡檢測法、酶聯免疫吸附法(ELISA)和分子生物學檢測方法(RT-PCR)。實時熒光RT-PCR方法是近年來發展起來的一種能有效縮短檢測時間、提高檢測靈敏度及準確度的新方法，廣泛應用于動植物病害的檢測。本研究應用實時熒光RT-PCR方法檢測甜(辣)椒種子，能夠快速靈敏地檢測出其中的PMMoV，對預防該病毒隨種子遠距離傳播有重要意義。建立種子中辣椒輕斑駁病毒快速、準確的檢測方法，對進出口種子檢驗檢疫、病毒病害防治預測具有指導意義。

1 材料與方法

1．1 供試材料

選擇自然侵染甜椒的4種病毒CMV、TMV、PVY、PMMoV作為研究對象，其中PMMoV的2個分離物均來源于茄門甜椒，經分離純化后分別保存在健康的甜椒上。本實驗室保存在普通煙上的TMV、枯斑三生煙上的CMV及克利夫蘭煙上的PVY。活體保存的植株葉片經DAS-ELISA檢測分別呈PMMoV、TMV、CMV、PVY陽性。甜椒是這4種病毒的自然寄主。

本實驗室保存的PMMoV衣殼蛋白基因部分克隆質粒為陽性對照，健康的甜椒葉片(DAS—ELISA檢測呈陰性)作為陰性對照。

1．2 儀器及試劑

1．2．1 儀器

ABIT000實時熒光PCR儀(美國ABI公司)，5417R臺式冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，德國R302DT71K4-2原葉榨汁機，美國TE-CAN公司的SUNRISE酶聯儀和洗板機。

1．2．2 試劑

熒光PCR：5×real-time PCR buffer(Mg²+free)、dNTP(s)(10 mmol/L)、MgCl₂(250 mmol/L)、ExTaq DNA聚合酶(5 U/uL)，AMV反轉錄酶(5 U/uL)、Rnase inhibitor(40 U/uL)購于寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

RNA提取試劑盒購于北京佰億新創科技有限公司(BioFlux)。4種病毒的酶聯檢測試劑盒購自Agdia公司。引物和探針由上海英駿生物技術有限公司合成。

1．3 試驗方法

1．3．1 探針及引物的設計與合成

GenBank中查詢并下載4種病毒衣殼蛋白核酸序列，并進行序列比對，根據PMMoV共同的衣殼蛋白特異序列設計TaqMan熒光探針及其引物，序列如下：探針P 5’-TGTCGGCACTTCTCG-GAGCCTTTG-3’，探針5’末端標記報告熒光染料6-FAM，3’末端標記淬滅熒光染料TAMRA，上游引物F 5’-TTAGATTTCCTGCTACTG-GTTTCAA-3’，下游引物R 5’-CAGTTGTAG-GATTTTGCGGATTT-3’。

1．3．2 病毒RNA的提取

按照RNA提取試劑盒說明書的步驟提取RNA。

1．3．3 反轉錄合成cDNA

在反應管中加dNTP(2.5 mmol/L)8uL、Rnaseinhibitor(40 U/uL)1 uL、5×AMV Buffer 4uL、AMV(5 U/uL)2 p.L、下游引物R(20/umol/L)uL、RNA模板1uL，加DEPC處理水使總體積為20 uL，混勻，室溫放置10 min，42℃水浴30 min，0℃冷卻2 min，合成cDNA。

1．3．4 實時熒光PCR檢測

1．3．4．1 反應體系

5×real-time PCR Buffer(Mg²⁺。free)5 uL、dNTP(s)(10 mmol/L)0.5uL、MgCl₂(250 mmol/L)0.25uL、ExTaq HS DNA聚合酶(5 U/uL)0.25uL、引物(20umol/L)各0.7uL，探針(20umol/L)0.3uL，eDNA模板1uL，加滅菌雙蒸水使總體積為25uL。試驗選取采集的兩個PMMoV分離物作為檢測對象，添加滅菌雙蒸水作為陰性對照，以監測試驗過程的環境污染。

1．3．4．2 樣本檢測

將樣品放入ABI 7000反應板上，打開電腦、儀器電源和軟件，設置PCR反應條件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃1 min，45個循環。熒光PCR反應約2 h結束，保存文件。

1．3．5 靈敏度測試

1．3．5．1 DAS-ELISA檢測的靈敏度測試

將0.1 g感染PMMoV的辣椒葉片榨汁，用抽提緩沖液SEBl稀釋汁液10×、10²×、10³×、10⁴×、10⁵×共5個濃度梯度，參照DAS-ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，加入底物后避光放置15 min用酶聯儀測定405 nm下的吸光值并觀察顏色變化。

1．3．5．2 實時熒光PCR檢測的靈敏度測試

從0.1 g感染PMMoV的辣椒葉片中提取的RNA依次稀釋10×、10²×、10³×、10⁴×、10⁵×共5個濃度梯度，反轉錄后進行實時熒光PCR檢測。

2 結果與分析

2．1 實時熒光PCR檢測

PMMoV毒源保存在甜椒上的葉片、感染TMV的普通煙葉片、感染CMV的枯斑三生煙葉片、感染PVY的克利夫蘭煙葉片以及從健康甜椒上采集的葉片提取RNA，反轉錄合成cDNA作為模板，用于實時熒光PCR反應。打開分析軟件，儀器自動分析試驗結果，給出ARn(第n個循環時的熒光增加值)與循環數圖像。反應結果表明：從檢測的克隆PM-MoV衣殼蛋白基因質粒、從感染PMMoV，的葉片材料收集到強的熒光信號，C_t值為22～25，表現為陽性擴增，相同寄主上的其他病毒TMV、CMV、PVY以及健康甜椒和水對照均無熒光信號增加，表現為陰性(圖1)，說明此探針及引物組合對PMMoV具有的特異性。

2．2 靈敏度試驗

對辣椒葉片汁液稀釋10×、10²×、10³×，經DAS-ELISA檢測結果均為陽性，對10⁴×、10⁵×稀釋的汁液檢測結果為陰性，檢測時間需要兩個工作日才能完成。實時熒光PCR檢測結果表明：當RNA稀釋到10⁵×時，實時熒光PCR仍能檢測到(圖2)。結果表明實時熒光PCR法比DAELISA檢測方法更靈敏，該實時熒光PCR法的建立將靈敏度由傳統的DAELISA至少提高了100倍，而且由樣品處理到獲得試驗結果僅需約3/5個工作日

3 結論與討論

辣椒輕斑駁病毒是甜椒上的一種重要病害，種子帶毒是遠距離傳播的重要途徑。用于病毒檢測的生物學方法檢測需時長，且需要大量的鑒別寄主；采用電子顯微鏡方法檢測需要昂貴的實驗儀器且需配備專業的技術人員；應用血清學方法檢測容易出現假陽性結果；應用普通PCR技術檢測需要進行反應后的EB染色處理，接觸易致癌且污染環境；采用實時熒光PCR技術檢測具有簡便快捷，特異性強、靈敏度高等特點，又由于整個過程無需對PCR產物進行后期處理，可以有效防止檢測過程中的污染及假陽性，大大提高了檢測速度，因此實時熒光PCR技術目前被認為是植物病原鑒定和病害診斷的革命性方式，將很快成為植物病害診斷中新的可靠方法。

本試驗根據辣椒輕斑駁病毒衣殼蛋白區域編碼序列，與侵染同寄主的其他病毒進行比較，設計了辣椒輕斑駁病毒的特異TaqMan熒光探針，從檢測結果上可以看出只有感染辣椒輕斑駁病毒的樣本進行熒光PCR檢測呈陽性，而煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒的熒光PCR檢測都呈陰性，說明設計的探針具有很好的特異性，所建立辣椒輕斑駁病毒實時熒光PCR檢測方法靈敏度高，是DAELISA法的100倍，同時大大縮短了檢測時間，實現了對辣椒輕斑駁病毒的靈敏、簡便、快速檢測，能夠很好地滿足種傳病害的快速診斷和進出口檢驗檢疫的需要。