植物青枯病高效生防菌株ＰＢＷ１培養(yǎng)工藝研究

摘要 植物青枯病生防菌株P(guān)BWl對植物青枯病的防效可高達(dá)70％以上。本文首先獲得了PBW1500 ml搖瓶培養(yǎng)的最佳條件：30℃、初始pH7、接種量為1％、裝液量為120 mL、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min；在最佳條件下培養(yǎng)48 h的菌體濃度達(dá)4.2×10¹² cfu/mL；同時(shí)還對500 mL搖瓶培養(yǎng)過程中菌體生長、還原糖、總糖及pH變化特征進(jìn)行了研究。此外，本文還在6L全自動發(fā)酵罐上對PBWl培養(yǎng)過程中的菌體生長、還原糖、氨基氮、pH和DO的變化特征進(jìn)行了研究，培養(yǎng)48h的菌體濃度達(dá)4.76×10¹²cfu/mL。

關(guān)鍵詞 植物青枯病；生物防治；PBW1菌株；培養(yǎng)工藝

中圖分類號 S476.1

植物青枯病是由茄青枯勞爾氏菌(Ralstonia so-lanacearum)引起的一種世界性土傳植物病害，主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)，發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重，此病于1864年首次發(fā)現(xiàn)至今已有140多年歷史。青枯病寄主范圍很廣，可侵染44科近300種植物，其中煙草、番茄、茄子、辣椒、花生、馬鈴薯和生姜等被害較嚴(yán)重、分布較廣。在我國，植物青枯病主要發(fā)生在長江以南地區(qū)(福建、廣東、廣西、四川、湖南、安徽、江蘇、浙江和江西等)，近年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此病有向長江以北地區(qū)(山東等地)發(fā)展的趨勢。植物青枯病發(fā)病率一般為20％～30％，嚴(yán)重的地區(qū)可高達(dá)100％，甚至毀產(chǎn)絕收。對于植物青枯病的防治研究，國內(nèi)外一直是以綜合防治為指導(dǎo)思想。綜合防治的重點(diǎn)又是放在抗病育種上，但迄今為止，具有抗青枯病性能的作物品種很少，且抗性極易丟失；嫁接方法防治番茄青枯病雖獲得成功，但技術(shù)難度大，難以推廣和普及；水旱輪作在一定程度上能夠較好地防治青枯病，但受地域條件的限制，難以被普遍應(yīng)用；化學(xué)農(nóng)藥防治雖有一定的防效，但難以達(dá)到最低的防治要求，且病原菌很快會對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性。由此可見，迄今為止，國內(nèi)外尚無防治植物青枯病的有效方法。近年來筆者所在實(shí)驗(yàn)室在利用微生物活菌制劑防治植物青枯病方面開展了大量的研究工作，利用獨(dú)特的菌種篩選模型篩選出防治番茄、辣椒、茄子、煙草等作物青枯病的高效生防菌株P(guān)BW1，為了更好地開發(fā)利用生防菌株P(guān)BW1防治植物青枯病，降低其培養(yǎng)成本，本文報(bào)道了植物青枯病高效生防菌株P(guān)BW1的搖瓶培養(yǎng)研究結(jié)果和在最佳條件下PBW1搖瓶培養(yǎng)過程中菌體生長、pH、還原糖及總糖變化特征；此外，本文還報(bào)道了生防菌株P(guān)BW1在6L全自動發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中菌體生長、總糖及氨基氮的變化特征。本文研究結(jié)果為PBW1的大規(guī)模培養(yǎng)工藝確定及其培養(yǎng)過程放大奠定了較好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種

為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離篩選出的植物青枯病高效生防菌株，暫定名為PBW1、初步鑒定為假單胞桿菌屬。

1．1．2 斜面培養(yǎng)基

蔗糖2％，淀粉2％，酵母膏1％，無機(jī)鹽和生長因子適量，瓊脂1.5％～1.8％，pH7。

1．1．3 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

蔗糖1％，酵母膏0.45％，無機(jī)鹽和生長因子適量，瓊脂1.8％，pH7。

1．1．4 搖瓶培養(yǎng)基

蔗糖2％，淀粉1.5％，酵母膏1.5％，無機(jī)鹽和生長因子適量，碳酸鈣0.6％，pH7。

1．2 主要設(shè)備

6L全自動發(fā)酵罐(德國B.Braun公司生產(chǎn))；控溫?fù)u床(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生產(chǎn))。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 種子培養(yǎng)

將菌株移入斜面培養(yǎng)基，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；將斜面菌體挖塊接入搖瓶(500 mL搖瓶裝入120 mL培養(yǎng)基)，在30℃、220 r.min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。

1．3．2 搖瓶培養(yǎng)

向裝有120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中接人1.2 mL種子液，在30℃、220 r.min的搖床上培養(yǎng)48 h或72 h。考察溫度、培養(yǎng)基裝量、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和初始pH等5個(gè)因素對最終培養(yǎng)液中菌體濃度的影響，確定最佳培養(yǎng)條件。

1．3．3 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將培養(yǎng)48 h的種子液，按1％的接種量(40 mL種子液)接入裝有6L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度控制為30℃，氣液比為1:1，泡敵加入量為0.05％，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速使溶氧不低于15％。培養(yǎng)過程的pH、溫度及溶氧自動記錄，間歇取樣測定培養(yǎng)液中的菌體濃度、還原糖及氨基氮。

1．3．4 分析方法

培養(yǎng)液中菌體濃度采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定；還原糖、總糖及氨基氮?jiǎng)t分別采用費(fèi)林試劑法和甲醛法。

2 結(jié)果與討論

2．1 搖瓶培養(yǎng)

考察溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、裝量、接種量等5個(gè)因素對PBW1菌株生長的影響，確定其最佳培養(yǎng)條件。

2．1．1 培養(yǎng)溫度

選定溫度為25、30、35℃和41℃進(jìn)行試驗(yàn)，由圖1可見溫度在30℃時(shí)，培養(yǎng)液中的最終菌體濃度為最大，高達(dá)4.5×10¹²。cfu.mL，在25℃和35℃下的菌體濃度分別為2.28×10¹²cfu.mL和7.8×10¹¹cfu.mL，而在41℃時(shí)的菌體濃度僅為1.01×10¹¹cfu.mL，菌體基本不生長。據(jù)此，可以認(rèn)為PBW1的生長溫度范圍為25～35℃，其最適生長溫度為30℃。

2．1．2 初始pH

在初始pH為5～10范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果見圖2，由該圖看出，PBWl在初始pH5～10范圍內(nèi)均能生長，最適生長的初始pH為7，這時(shí)菌體濃度為4.4×10¹²cfu.mL，這表明該菌適宜在pH中性范圍生長。

2．1．3 轉(zhuǎn)速

由圖3可見，PBWl在轉(zhuǎn)速分別為130、170、220 r.min和250 r.min條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液中的菌體濃度依次為4.1×10¹¹、1.35×10¹²、2.83×10¹²、4.5×10¹²cfu.mL。轉(zhuǎn)速越高，供氧量越大，試驗(yàn)結(jié)果可說明在一定條件下溶氧濃度越高，越有利于PBW1的生長。

2．1．4 裝液量

在500 mL搖瓶中分別裝入70、120、170 mL和220 mL培養(yǎng)基(接種量仍為1％)，培養(yǎng)48 h后的菌體濃度依次為4.7×10¹²、4.4×10¹²、2.32×10¹²cfu.mL和9.9×10¹¹cfu.mL(圖4)，結(jié)果表明裝液量越少，PBW1生長越快。由于裝液量太少，不利于取樣分析，且裝液量為70 mL時(shí)菌體生長和裝液量為120 mL時(shí)相近，故裝液量選為120 mL。在相同條件下，裝液量越少，相對供氧量越大，PBW1生長越快，這和轉(zhuǎn)速試驗(yàn)結(jié)果一致。

2．1．5 接種量

在其他條件相同情況下，接種量分別為0.5％、1％和1.5％時(shí)，培養(yǎng)72 h后相應(yīng)的培養(yǎng)液中的菌體濃度分別為2.82×10¹²、4.2×10¹²、4.6×10¹²cfu.mL，結(jié)果表明培養(yǎng)PBWl時(shí)，在一定范圍內(nèi)，接種量越大，菌體生長越快，但接種量為1％和1.5％時(shí)培養(yǎng)72 h的培養(yǎng)液中的菌體濃度差別不大(圖5)，因而一般選定接種量為1％。

2．1．6 搖瓶培養(yǎng)的最佳工藝條件

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，在本文試驗(yàn)條件下，PBWl最佳的500 mL搖瓶培養(yǎng)工藝為：30℃、初始pH7、接種量為1％、裝液量為120 mL、搖床轉(zhuǎn)速為220 r.min。在一定范圍內(nèi)，接種量越大，菌體生長越快；搖床轉(zhuǎn)速越大、裝液量越少，菌體生長越快，這說明在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中溶氧越大，越有利于PBW1的生長。

2．2 PBW1搖瓶培養(yǎng)過程中菌體濃度、pH、還原糖

及總糖變化特征

在最佳工藝條件下進(jìn)行PBW1的培養(yǎng)，測定其培養(yǎng)過程的菌體濃度、pH、還原糖及總糖變化曲線，所得結(jié)果示于圖6。由該圖可見，培養(yǎng)前期菌體生長較快，而培養(yǎng)至約24 h時(shí)，菌體生長速度很緩慢，培養(yǎng)至約100 h后，菌體濃度開始下降，這可能是菌體自溶所致。培養(yǎng)開始后pH下降，至約24h，pH降至最低，隨后開始上升，至約48 h時(shí)pH上升速度開始變得很緩慢。在培養(yǎng)前期還原糖和總糖消耗速度較慢，但在20～36 h內(nèi)糖消耗較快，以至于還原糖濃度接近于0，隨后糖濃度基本不變。菌體濃度的變化與pH、還原糖及總糖的變化有一定的相關(guān)性，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行至約36 h時(shí)，培養(yǎng)液中還原糖和總糖濃度降至很低，pH升到8.51，菌體生長已基本進(jìn)入平衡期，菌體濃度略有增加，考慮到菌體濃度在48 h以后增加不大，因此，選擇48 h為搖瓶培養(yǎng)終點(diǎn)，此時(shí)菌體濃度為4.2×10¹² cfu.mL。

2．3 菌株的發(fā)酵罐培養(yǎng)過程特征

圖7所示的為PBW1在全自動發(fā)酵罐中的培養(yǎng)過程曲線。由該圖可見，在0～4 h內(nèi)菌體生長處于延滯期，4～12 h期間菌體生長很快，在隨后的6 h內(nèi)菌體生長緩慢，并達(dá)到最大菌體濃度；18 h以后，菌體濃度出現(xiàn)下降趨勢，結(jié)合氨基氮的變化曲線初步判斷，這可能是有部分菌體自溶所致。在0～4 h內(nèi)還原糖濃度和氨基氮濃度下降很緩慢，在4～12 h內(nèi)，還原糖濃度、氨基氮濃度降低較快，同時(shí)菌體生長速度較快，在隨后的6 h內(nèi)還原糖和氨基氮濃度下降緩慢，18 h以后，還原糖濃度變化非常緩慢，而氨基氮濃度開始上升，這表明菌體停止生長，可能出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。在4 h以前，pH變化緩慢，在4～12 h，pH下降速度較快，說明菌體利用糖產(chǎn)生有機(jī)酸，使pH降低較快，12 h以后，pH開始緩慢回升，說明培養(yǎng)液中糖濃度很低，菌體生長開始利用有機(jī)酸，使pH出現(xiàn)回升。在2 h前，溶氧濃度降低較為緩慢，但2～4 h內(nèi)溶氧下降很快，至4 h時(shí)降到最低點(diǎn)，這時(shí)菌體生長速度較快，為了維持溶氧不低于15％，轉(zhuǎn)速由600 r.min調(diào)至700 r.min，此時(shí)，菌體生長很快，耗氧量大，溶氧下降快，約6 h時(shí)將轉(zhuǎn)速由700 r.min增至800 r.min，在9～12 h內(nèi)，溶氧下降緩慢，隨后的2 h內(nèi)溶氧開始上升，菌體生長緩慢，在約14 h時(shí)，將轉(zhuǎn)速降為700 r.min，說明菌體可能開始死亡或自溶，到30 h，菌體濃度降至很低，溶氧開始回升。由此可見溶氧變化曲線可反映菌體的生長狀況。

3 結(jié)論

(1)以青枯病高效生防菌株P(guān)BW1的培養(yǎng)為研究對象，以最終的菌體濃度的高低為指標(biāo)，研究了PBWl在500 mL搖瓶中的最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：在本文試驗(yàn)范圍內(nèi)，PBWl搖瓶培養(yǎng)的最佳工藝為：30℃、初始pH7、接種量為1％、500 mL搖瓶裝液量為120 mL、搖床轉(zhuǎn)速為220 r.min。在一定范圍內(nèi)，接種量越大，菌體生長越快；搖床轉(zhuǎn)速越大、裝液量越少，菌體生長越快，這說明在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中溶氧越大，越有利于PBW1的生長。

(2)在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)48 h時(shí)的菌體濃度達(dá)4.2×10¹²cfu.mL；同時(shí)獲得了PBW1菌株的搖瓶培養(yǎng)過程中的菌體生長、pH、還原糖及總糖變化特征。

(3)利用搖瓶培養(yǎng)結(jié)果，在6L全自動發(fā)酵罐上進(jìn)行了PBWl的培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)18 h的菌體濃度達(dá)最大，其值為4.76×10¹²cfu.mL；同時(shí)對PBW1在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的菌體生長、pH、還原糖、氨基氮及溶氧的變化特征進(jìn)行了研究，這為PBWl的大規(guī)模培養(yǎng)提供了一定的依據(jù)。