乙型肝炎病毒感染模型應用新進展

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；感染模型；轉基因技術

文章編號：1003-1383(2008)02-0222-04中圖分類號：R 512.62文獻標識碼：A

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染具有明顯的種屬特異性，是目前知道的最小的嗜肝DNA病毒，在易感宿主細胞內易于附著、侵入和復制，并可長期持續感染。然而，HBV的易感宿主范圍很狹窄，僅限于人、黑猩猩等靈長類動物，故很難在普通實驗動物中建立疾病模型。因此，建立適合于HBV研究、簡單易得的實驗模型一直是研究者們追求的目標。在過去的20多年間，國內外學者陸續建立了多種相應的嗜肝DNA病毒模型，但尚無一個理想的模型可準確地代表人HBV感染的所有特征。自轉基因技術出現以后，HBV轉基因小鼠的研制使HBV研究取得了很大的發展。近年來，人鼠嵌合模型的研究成為熱點。本文將從細胞模型和動物模型兩方面對模型在HBV研究中的應用作系統綜述。

HBV感染基因及原代培養的細胞模型

細胞模型目前研究的有人肝癌細胞和HBV感染原代培養的肝細胞兩個模型。人肝癌細胞模型有三個不同的細胞系建株：

①PLC/PRF/5細胞系，由人肝癌細胞建株，具有不產生清蛋白，不含HBV DNA的游離分子（所有HBV DNA分子均整合到細胞DNA中），只表達少量HBsAg，不產生抗殼抗原和Dane顆粒等特點，故此細胞系主要用于研究感染HBV后，相關細胞因子對肝臟細胞的生物學效應，如抑制因子對肝細胞的作用［1］；也可用于一些抗病毒藥物的研究，如反義寡核苷酸等對HBsAg的抑制作用［2］。

②HepG2細胞系，是由肝胚瘤細胞的活體組織建株，通過轉染HBV全基因到肝癌細胞，具有肝細胞所特有的絕大部分功能，可分泌多種血漿蛋白和表達HBsAg和HBeAg，主要用于HBV DNA結構與功能、HBV對肝細胞的作用、抗病毒藥物與HBV感染的關系等研究［3］。

③HepG2.2.15細胞系，則是應用重組載體pDOLTHBV1轉染HepG2細胞，可獲得穩定分泌病毒蛋白和病毒顆粒的細胞克隆，這個細胞系能穩定分泌大量的HBsAg、HBeAg和Dane顆粒，細胞內可檢到HBV DNA和RNA，但無cccDNA。細胞中不同部分整合的分子，含有頭－尾連接的拷貝，也含有cDNA和單鏈DNA，因此，HepG2.2.15細胞系成為應用最廣泛的乙型肝炎細胞模型［4］。此外，HepG2.2.15細胞系可持續長時間地維持病毒復制，經多代培養仍保持病毒復制，病毒復制水平較低，但因其可分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA和完整的病毒顆粒，故還可用于抗HBV感染基因治療的研究［5］。盡管如此，HepG2.2.15細胞系仍然存在以下問題，致使其應用受到一定限制，即HBV是整合在宿主細胞染色體上，復制方式與自然感染不同，且不能被清除；病毒復制的水平不能人為改變；病毒復制水平較低；細胞培養中不產生cccDNA。

而HBV感染原代培養的肝細胞模型是在原代正常人肝細胞培養中加入含HBV顆粒的血清或在正常鴨肝細胞培養中加入DHBV，均可構建HBV感染的原代培養肝細胞模型。Springzl等［6］利用AdHBV 1.3分別感染人原代肝細胞、小鼠肝細胞、大鼠肝細胞、樹鼩肝細胞、鴨肝細胞和HepG2細胞，應用southern、northern、westernblot等方法評價。發現該細胞系與HepG2.2.15細胞系相比，具有高效轉移、表達cccDNA，可對HBV突變和表達進行人為調控等優點，故主要用于研究HBV對正常人肝細胞附著、HBV病毒早期感染過程、DHBV外膜蛋白抗體的抗感染作用以及抗病毒藥物篩選等。但是，DHBV與HHBV的基因結構存在差異，其結果的應用受到一定限制。

建立感染HBV動物模型的研究現狀

黑猩猩是HBV研究最具有代表性的動物模型，因為在所有動物中，靈長類與人類具有最近的親緣關系，而黑猩猩與人類的親緣關系最接近。受HBV感染的黑猩猩絕大部分出現典型急性乙肝癥狀，細胞免疫反應與人類相似，因此可用于進行急性乙型肝炎機體免疫和肝臟病理方面的研究；少部分形成慢性感染，又可用來研究HBV持續感染的機制。但由于黑猩猩屬瀕危動物、來源困難、價格昂貴，且不易誘發重癥與癌變，應用受到限制。

產于我國云南、廣西一帶的低等小型靈長類動物樹鼩，在生理機能、生化代謝和基因組成等方面與人類具有相似性，是目前已知除黑猩猩外唯一能感染人HBV的動物品系，而且樹鼩比較能適應實驗環境，因此，樹鼩有望成為HBV感染的實驗小動物模型。有資料報道用人HBV接種樹鼩發現肝臟細胞內有HBV DNA復制，血清ALT明顯升高。可見樹鼩可用于研究HBV感染機制、抗HBV藥物篩選、乙肝疫苗安全性和免疫效果評價等。然而，樹鼩目前多以野生繁殖為主，捕獲后短期飼養便進行實驗，實驗結果穩定性較差。此外，樹鼩感染人HBV后轉為慢性感染的成功率尚待提高［7］。目前研究發現一些禽類和哺乳類動物都可感染HBV。因此建立嗜肝DNA病毒動物模型倍受重視。目前研究較多的是鴨乙型肝炎病毒（DHBV）是禽類嗜肝DNA病毒，其核酸組成與人HBV僅有40%~70%同源性，無X開放讀碼框，膜蛋白基因只編碼非糖基化的大、小蛋白，無中蛋白。鴨子是DHBV的自然宿主，其自然感染方式主要為垂直傳播，因此，先天性或幼年感染的雛鴨可發展為持續性DHBV感染。國內各地采用當地成熟或雛鴨建立模型，如廣州麻鴨、北京麻鴨等。盡管DHBV進入鴨肝細胞的分子機制可能與人不盡相同，但是通過對DHBV模型的研究，在一定程度上闡述了乙肝病毒的復制機制和共價閉合環狀DNA（cccDNA）的作用。DHBV模型也可用來評價臨床前期抗病毒藥物，如核苷類似物、反義寡核苷酸等治療效果［8］。雖然鴨感染DHBV的具體特征與人類感染HBV有一定差異，但是鴨易于孵育飼養、經濟、易得，并能建立病毒持續感染和提供一個與HBV相似的體內實驗系統，因此，鴨乙型肝炎病毒模型被廣泛應用。土撥鼠肝炎病毒（WHV）是哺乳類嗜肝DNA病毒，與人HBV基因組DNA序列同源性高于DHBV，約為70%以上，且基因組結構也相似。慢性感染WHV的土撥鼠可發展為重癥肝炎和肝癌，其表現明顯類似于人類感染HBV，且僅在肝、脾中發現有WHV DNA復制中間體和WHV RNA，故土撥鼠適用于研究HBV慢性感染的發病機制和抗乙肝病毒藥物研究［9］。但土撥鼠來源困難，我國西北地區自然存在與土撥鼠同種同屬的“旱獺”，可用于構建HBV感染的動物模型。張珺等［10］的研究結果顯示，新疆灰旱獺肝組織中嗜肝病毒表面抗原檢出率達82.2%，提示可以利用我國豐富的旱獺資源建立HBV感染的動物模型方面研究。然而，WHV與HBV在分類、結構和生物學功能等方面不完全相同，故WHV動物模型在研究HBV感染機理及復制過程中的應用受到一定限制。

復制轉染HBV小鼠模型的臨床意義

Chisari等使用顯微注射法首次建立了HBV轉基因小鼠模型，目前該模型可分為HBV部分序列、全基因序列和超長序列轉基因鼠模型。HBV部分序列轉基因小鼠模型只表達單一基因產物，不能產生病毒，因此不適宜用于病毒復制的研究。而屠亞軍等［11］所建立的人HBVx基因轉基因小鼠模型，可用于研究慢性乙型肝炎患者誘發肝癌的機制及HBX的反式激活機制。HBV全基因或超長序列轉基因小鼠具有病毒DNA復制及蛋白質合成的能力，能產生較高水平的血清HBsAg及HBeAg，血清中可檢出HBV DNA，認為該類模型可用于評價抗病毒藥物的療效。作為一種新策略，siRNA顯示了潛在的良好的治療效果，它通過降解與目的基因相似的雙鏈RNA可致靶基因沉默，針對HBV的siRNA可通過重組腺病毒載體有效地進入轉基因小鼠的肝臟，完全抑制轉基因鼠中HBV達4周之久，顯示了siRNA的治療效果［12］。宿主對HBV感染產生免疫耐受，但不引發體內的免疫清除，這是HBV感染后形成慢性化的主要機制之一。因轉基因小鼠對HBV抗原處于免疫耐受狀態，還可用于研究感染慢性化的形成機理。熊一力等［13］在研究樹突狀細胞的抗原提呈功能時，發現轉基因小鼠對HBV的抗原提呈能力低下，同時觀察到小鼠的T淋巴細胞免疫活化受到抑制，鼠肝細胞應答能力下降，由此推測樹突狀細胞的抗原提呈能力下降，是宿主對HBV產生免疫耐受的關鍵。此外，轉基因小鼠還可用于慢性HBV攜帶者的免疫反應缺陷機理、HBV持續感染中抗原提呈細胞作用規律等方面的研究。

盡管HBV轉基因小鼠模型在研究HBV感染時顯示了非常好的優勢，但仍存在一些缺陷：①HBV轉基因小鼠的HBV DNA雖完全整合到小鼠基因組上，但與HBV自然感染人體的狀態有所不同；②轉基因小鼠具有遺傳不穩定性；③鼠肝內缺乏cccDNA病毒轉錄模板的形成，進入鼠肝細胞內的HBV復制時不具有完整的生活周期，不能完全模擬出病毒在人體內的復制過程；④操作復雜、整體費用高；⑤轉基因鼠的免疫耐受狀態跟人體感染HBV后的免疫反應過程存在一定差異。

研究認為，表達特定基因的轉基因鼠可用來研究某些特定基因表達產物對HBV的影響和潛在的致癌性。資料顯示在S基因過度表達的轉基因小鼠中，HBsAg大量產生，堆積在肝細胞的內質網，對肝臟產生毒性，引起慢性肝損傷、炎癥、增生及轉錄失控，嚴重的可引起染色體缺失，出現肝癌［14］。為了探索X蛋白在肝癌形成中的潛在作用，制備HBVx或WHVx基因的轉基因鼠，使X蛋白過度表達，結果證明X蛋白在體內可以促進病毒的復制，顯著提高病毒蛋白的表達，并且肝臟內X蛋白表達程度跟肝癌產生存在相關性，這可能是X蛋白能削弱p53的功能所致［15］。

為了克服鼠類對HBV不易感的缺陷，研究者構建了重組腺病毒和桿狀病毒載體，攜帶具有復制能力的HBV基因，轉染培養的細胞系或原代肝細胞及給小鼠尾靜脈注射，在肝細胞內出現HBV復制，并檢出cccDNA，結果顯示腺病毒攜帶外源基因進入肝臟的效率高于桿狀病毒，且容易被補體系統滅活，因此，認為桿狀病毒不適合用于體基因轉移的研究。重組腺病毒載體與HBV 1.3構建的AdHBV 1.3體系靜脈注射小鼠后，在鼠肝細胞內檢出HBV的復制，但是由于機體的免疫系統作用，致使HBV不能長期感染，因此，腺病毒載體構建的病毒感染模型應用受到一定限制［16］。

采取流體動力學注射法在小鼠尾靜脈一次性快速高容量（1.6ml/20g小鼠）注射質料，可以提高HBV基因的轉染率。資料顯示，應用流體動力學法同時注射表達HBV的質料和針對HBV的siRNA能夠抑制病毒的復制［17］。認為流體動力學法注射導致HBV感染的模型可以用作研究抗病毒策略。與轉基因小鼠相比，該模型有兩個優點：①該模型既可用于急性HBV感染時機體免疫應答的研究，也可用于抗病毒藥物及機體自發清除病毒的機制研究；②該模型還可用研究某些變異的病毒或人工突變的病毒在體內的復制能力。

探索嵌合體HBV復制治療的新途徑

要研究病毒早期感染階段的機制、cccDNA的功能、病毒的細胞間擴散感染及病毒清除，就需要能夠支持HBV感染以及復制的種屬特異性肝細胞，由于體外培養的肝細胞內進行研究HBV不能完全模擬體內復制并具有其他缺陷等。最近研究報道了一些新的模型，將已感染或未感染HBV的人肝細胞移植到小鼠體內，作為研究HBV感染的良好體內模型。目前研究的主要有三種模型，

①三合體小鼠模型：HBV三合體小鼠（trimera mouse）是由Tlan等［18］首次建立的，即通過將感染有HBV的人肝臟組織片移植到Balb/c（已經SCID小鼠骨髓細胞重構免疫系統）小鼠，約有80%的小鼠出現病毒血癥。血清中的病毒滴度比較低，維持時間僅20天，但短期觀察抗病毒的療效還是可行的。Trimera系統為研究HBV的復制、治療提供了新途徑。只是該模型中植入的人肝細胞只能在有限的時間內發揮作用，致使其不能長期研究。

②移植人肝細胞的免疫缺陷鼠模型：為了使植入的人肝細胞在鼠體內存活時間延長，人們探索將人肝細胞植入到免疫缺陷的小鼠肝臟構建模型。資料顯示［19］，在缺失RAG2的小鼠肝臟內注射含HBV基因的永生化肝細胞，可長時間產生HBV，鼠內病毒滴度持續5個月之久。蔣黎等［20］報道在孕鼠子宮內注射人胎肝細胞，誘導胎鼠對人肝細胞產生免疫耐受，胎鼠出生后24 h內給新生小鼠脾臟內注射人胎肝細胞，1周后接種含人HBV的血清，建立針對人胎肝細胞耐受的人鼠嵌合肝動物模型，結果在鼠肝組織中能檢測到CK18、HBsAg的表達。

③uPA轉基因小鼠模型：uPA即尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物。uPA轉基因鼠因其肝細胞能特異表達AlbuPA轉基因，誘導攜帶有該基因的肝細胞凋亡，引起肝細胞特異性損傷，從而利于移植細胞在該肝臟中的長期存活。Dandri等［21］將uPA轉基因鼠跟RAG2基因缺陷鼠雜交，后代被植入旱獺肝細胞，由于RAG2基因缺陷鼠不能表達RAG2，故T、B淋巴細胞不能成熟，不具備完整的免疫功能，對外源肝細胞不排斥。因此，植入的肝細胞不斷生長幾乎取代整個鼠肝臟，且鼠內存在旱獺病毒的感染及復制。有報道［22］稱人肝細胞植入2~3周齡的UPA/RAG2鼠內，在鼠肝中觀察到人肝細胞特有因子表達及人肝細胞和鼠肝實質間出現膽管溝通。另有實驗報道，給純合子SCIDUPA雜交鼠植入人原代肝細胞后可以形成幾乎完全的人肝細胞化的鼠肝臟。給該模型接種含HBV血清可長達5個月之久觀察到高滴度的HBV［23］。該嵌合體作為研究HBV體內感染的小鼠模型，可反映HBV自然感染的全過程，優于黑猩猩及其他動物模型，但不適合用于研究HBV發病機制。

目前用于乙型肝炎相關研究的模型主要存在的問題是未能建立起在生物學分類上與人類相近，并具有感染率高，感染持續時間長，感染后肝組織或肝細胞的病理改變類似人乙型肝炎以及經濟適用的研究模型。據以上所述，黑猩猩、樹鼩等靈長類動物跟人類親緣關系相近，更適合用于研究HBV感染，但這類動物珍貴難得而應用受到限制。應用較多的還是鴨、轉基因鼠和HBV細胞模型，土撥鼠模型則在國外應用較多。但無論是非人類靈長類動物模型，還是簡單易得的其他模型，作為有實驗價值的HBV感染模型，必須具備2個條件：一是要有高水平的HBV基因表達及復制；二是要伴有持續性病毒復制和基因表達的慢性HBV感染。總之，建立對人HBV易感，且具有與人感染HBV后相同或相似的肝臟病理改變及疾病轉歸研究模型，將能促進人類攻克乙型肝炎的進程。

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(收稿日期：2007-09-17 修回日期：2008-04-03)

(編輯：崔群飛)