豬卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)研究進(jìn)展

摘要：綜述了豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時(shí)對保存效果、影響保存的因素、保護(hù)劑的選擇等進(jìn)行探討。最后，展望了豬卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；冷凍保存；豬

中圖分類號：S828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號：1006—6500(2008)03—0027—03

近年來，隨著動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的迅速發(fā)展，對卵母細(xì)胞的需求日益增加，僅通過回收體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞已經(jīng)無法滿足科研和生產(chǎn)的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細(xì)胞，可望成為一條有效的途徑。動(dòng)物卵母細(xì)胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動(dòng)物的卵母細(xì)胞，不但可以建立雌性動(dòng)物的基因庫，還可充分利用卵母細(xì)胞資源，使體外受精、轉(zhuǎn)基因和核移植技術(shù)研究不受時(shí)間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實(shí)現(xiàn)胚胎的體外生產(chǎn)，也可為胚胎生物技術(shù)提供豐富的材料來源。豬卵母細(xì)胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學(xué)的理論、方法和實(shí)踐提供重要的依據(jù)。

1 豬卵母細(xì)胞的冷凍保存方法

1.1 玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細(xì)胞置于高濃度冷凍保護(hù)液中，經(jīng)短時(shí)間平衡或不平衡，直接投入液氮保存。卵母細(xì)胞在冷凍液中脫水至一定程度后，內(nèi)源性胞質(zhì)大分子(如蛋白質(zhì)、脂類)及已滲透入胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃縮，在冷凍過程中形成胞內(nèi)玻璃化而不形成冰晶，因而避免了細(xì)胞內(nèi)形成冰晶造成的化學(xué)和物理損傷，使卵母細(xì)胞得到保護(hù)。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護(hù)劑預(yù)平衡3～5min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經(jīng)液氮熏蒸1～2min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點(diǎn)是細(xì)胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行。

1.1.1 麥管(Straw)法 以EFS40作為玻璃化冷凍液。GV期或MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)TCM199清洗后轉(zhuǎn)移到EFS20中，平衡1min，再轉(zhuǎn)移到數(shù)個(gè)約100μL的EFS40小滴中，每滴約含卵母細(xì)胞15枚，并平衡1min。利用虹吸或注射器吸入麥管。裝完管后，在液氮蒸汽中平衡3min后投入液氮或直接投入液氮中。

1.1.2 GMP管法 卵母細(xì)胞平衡后吸入GMP管。吸入的物質(zhì)全部為含卵母細(xì)胞的冷凍液。裝管完成后，在液氮蒸汽中平衡3min后投入液氮。

研究表明GMP的內(nèi)徑較小，且熱傳導(dǎo)性能好，故降溫速率更快，冷凍效果好；此外，GMP還可以克服OPS管在液氮中容易上浮和炸裂的缺點(diǎn)，便于儲(chǔ)存。

1.2 程序化冷凍

卵母細(xì)胞用冷凍保護(hù)劑平衡處理后，以1℃/min速度降溫，在-5～-7℃誘發(fā)結(jié)晶，然后以0.3～0.8℃/min的速度降溫至一30～-40℃，投入液氮中保存。將GV期或MⅡ期卵母細(xì)胞在TCM199中洗2-3次，轉(zhuǎn)移到冷凍保護(hù)劑(EG，DMSO，Gly)中，進(jìn)行逐步濃度梯度平衡。然后裝入0.25mL的塑料麥管，每管含卵母細(xì)胞約15枚。裝管完成后，放人已設(shè)置好的程序化冷凍儀中。

1.3 OPS法

Vajta等使用OPS法獲得成功，大大提高了豬卯母細(xì)胞的存活率。他將普通0.25mL細(xì)管加熱，拉制成約為原來1/2的內(nèi)徑，將胚胎放入1～2μL的冷凍液后利用虹吸法將卵母細(xì)胞吸入拉制后的OPS管。由于OPS管內(nèi)徑更細(xì)，減少了卵母細(xì)胞周圍的冷凍液量，從而使冷凍速率大大提高，使卵母細(xì)胞在冷凍過程中可迅速通過致死溫區(qū)而不至于受到損害。Francoise等已利用OPS法冷凍豬卵母細(xì)胞，移植后獲得凍胚仔豬。

1.4 微滴法

微滴法(microdroplet)是使用微量冷凍液進(jìn)行冷凍的一種方法。將含有卵母細(xì)胞的冷凍小滴(約6μL)直接滴入到液氮中凍成固態(tài)，然后收集這些固態(tài)顆粒于小管中，置于液氮中保存。另一種做法是，先在1mL冷凍管中做成含卵母細(xì)胞的微滴，然后將冷凍管直接投入液氮中保存。微滴法操作簡單，在豬上的應(yīng)用也取得突破。Misumi等用微滴法保存豬卵母細(xì)胞，解凍并培養(yǎng)24h后，卵母細(xì)胞存活率為91.3％，顯著高于細(xì)管法，經(jīng)胚胎移植后共獲得27頭仔豬，表明有較好的效果。

1.5 電鏡銅網(wǎng)法

電鏡銅網(wǎng)法是新近出現(xiàn)的一種玻璃化冷凍方法。它利用電鏡銅網(wǎng)作為卵母細(xì)胞載體，使卵母細(xì)胞處于小體積(1μL)冷凍液中，然后直接投入液氮保存，其冷凍速率可達(dá)3000℃/min以上。Martino等用電鏡銅網(wǎng)法凍存豬卵母細(xì)胞，解凍后形態(tài)正常率為60％，體外受精后卵裂率和囊胚發(fā)育率分別達(dá)到29％和10％。

1.6 固體表面法和冷凍環(huán)法

Begin等用固體表面法(solid-surface vitri-fi-cation，SSV)和冷凍環(huán)法(cryoloop virification，CLV)進(jìn)行豬卵母細(xì)胞的超低溫冷凍，其中，SSV法是將含有卵母細(xì)胞的冷凍液滴到浸入液氮的金屬表面，其卵母細(xì)胞凍后存活率為60％，而CLV法是將含卵母細(xì)胞的冷凍液滴于冷凍環(huán)薄膜上，然后浸入液氮，結(jié)果取得了89％的存活率。

1.7 其他方法

除了在冷凍載體上進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)之外，添加保護(hù)因子和對卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞處理也能改善豬卵母細(xì)胞的凍存效果。Men等在研究體外生產(chǎn)豬囊胚超低溫冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn)，向體外發(fā)育培養(yǎng)基中加入胎牛血清，能顯著提高解凍后的胚胎存活率。在細(xì)胞處理方面，有學(xué)者在凍存豬卵母細(xì)胞之前，顯微去除其內(nèi)脂肪顆粒或先進(jìn)行離心后再凍存，結(jié)果大大提高了卵母細(xì)胞的存活率，證明去脂處理是提高凍后存活率的方法。此外，Dobrinsky等證明在冷凍液中加入細(xì)胞松弛素B，也能提高豬卵母細(xì)胞的冷凍效率。

2 豬卵母細(xì)胞的解凍方法

2.1 玻璃化法解凍

麥管或GMP管取出液氮罐，在37℃的空氣中平衡后，推注到塑料皿中，用移卵管直接轉(zhuǎn)移到0.5mol/L蔗糖溶液中平衡5～10min，平衡好后洗滌。

2.2 程序化法解凍

冷凍保存一段時(shí)間后，從液氮中取出麥管，在空氣中平衡10s，再投入到37℃的恒溫水中平衡20s，擦凈附在麥管上的水珠，用帶橡皮套的注射器將含卵母細(xì)胞的冷凍液推注于10cm的塑料皿中。用移卵管吸取卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到低濃度的冷凍液中進(jìn)行稀釋。以EG為例來說明，先將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6％EG中平衡5min；再轉(zhuǎn)移到3％EG中平衡5min；平衡好后，再轉(zhuǎn)移到0.5mol/L蔗糖溶液中平衡5min；之后，轉(zhuǎn)移卵母細(xì)胞至TCM199(含10％FCS，下同)，洗滌3～4次。

3 豬卵母細(xì)胞冷凍效果評價(jià)

3.1 形態(tài)學(xué)評價(jià)

冷凍一解凍后的卵母細(xì)胞經(jīng)洗滌數(shù)次后放到較高倍數(shù)的倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。凡能恢復(fù)到正常狀態(tài)，胞質(zhì)飽滿、均一，透明帶完整，GV期卵母細(xì)胞外卵丘細(xì)胞未脫落等視為形態(tài)正常。

3.2 體外培養(yǎng)

冷凍一解凍后的GV卵母細(xì)胞在TCM199成熟培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)44h后，能看到其外卵丘細(xì)胞擴(kuò)散(擴(kuò)散，但范圍小)的，視為有活力。擴(kuò)散范圍大者(>5倍卵母細(xì)胞直徑)或有pbI出現(xiàn)者，視為具有發(fā)育能力。

3.3 臺(tái)盼藍(lán)染色

將洗脫抗凍劑后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到0.3％臺(tái)盼藍(lán)中，37℃染色3min，然后洗滌4～5次，放到實(shí)體鏡下觀察。活的卵母細(xì)胞不著色，死的卵母細(xì)胞藍(lán)染。FDA(二乙酸熒光素)染色：卵母細(xì)胞脫除抗凍劑后，放到5％～10％FDA染色液中，37℃染色3min，放到TCM199中洗滌3-5次，立即拿到熒光顯微鏡下觀察。胞質(zhì)發(fā)熒光的卵母細(xì)胞視為有活力，不發(fā)熒光視為死細(xì)胞。

3.4 體外受精鑒定

將冷凍一解凍后的MⅡ期卵母細(xì)胞體外受精，若有卵裂現(xiàn)象說明該卵母細(xì)胞具有發(fā)育潛力。

4 影響豬卵母細(xì)胞冷凍的因素

4.1 常見因素

豬卵母細(xì)胞在冷凍一解凍的過程中由于受很多因素的影響，造成了其冷凍效率低，克服這些常見因素的影響是低溫生物學(xué)的一項(xiàng)重要課題。常見的卵母細(xì)胞受損因素可歸納如下：(1)細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞；(2)細(xì)胞外冰晶形成，引起物理損傷；(3)冷凍保護(hù)劑的毒性；(4)胞膜內(nèi)外滲透壓差引起細(xì)胞萎縮或膨脹；(5)冷凍對細(xì)胞的損傷；(6)細(xì)胞質(zhì)量等。因此，超低溫冷凍卵母細(xì)胞的存活取決于滲透性抗凍保護(hù)劑通透性的快慢、化學(xué)毒性的大小和非滲透性抗凍保護(hù)劑的滲透壓作用及有無冰晶生成等。傳統(tǒng)的程序冷凍方法一般采用EG、DMSO、Gly等為主體的滲透性抗凍保護(hù)劑，因其濃度低、對細(xì)胞的化學(xué)毒性較小，故凍前需較長的降溫冷卻時(shí)間，另外還需要人工植冰，冰晶的生成會(huì)對細(xì)胞造成物理性的損傷而影響其活力。而添加大分子物質(zhì)蔗糖可使溶液不生成冰晶，在冷凍過程中可以解除對卵的化學(xué)毒性。因此對豬卵母細(xì)胞的冷凍效果明顯好于傳統(tǒng)程序化冷凍。

另外，近十年來研究者改細(xì)管冷凍法為OPS法，由于提高了降溫速度，可減少冷凍損傷。又因?yàn)槁涯讣?xì)胞與高濃度的玻璃化溶液接觸時(shí)間小于1min，從而大大減小了化學(xué)毒性和滲透性的損傷，使豬卵母細(xì)胞冷凍保存有所突破。

4.2 特殊因素

眾所周知，豬卵母細(xì)胞中含有大量的脂肪顆粒，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，這使它本身對溫度更敏感，更易于受到損傷，是豬卵母細(xì)胞較難凍存的重要原因。

5 冷凍保護(hù)劑的選擇

很多學(xué)者在冷凍劑的種類和濃度上做了大量的研究，試圖找出一種適合于豬卵母細(xì)胞冷凍的最佳程序。Huang等以細(xì)胞毒性試驗(yàn)來研究Gly、DMSO、EG、1，2-丙二醇(PROH)4種常用的冷凍保護(hù)劑對豬卵母細(xì)胞的影響。結(jié)果說明在豬卵母細(xì)胞凍存上，各種冷凍保護(hù)劑均具有保護(hù)豬卵母細(xì)胞的作用，但效果不一樣，甘油的效果較差，EG相對較好。然而，許多研究者在冷凍保存豬卵母細(xì)胞時(shí)，仍選擇甘油作冷凍保護(hù)劑。因此，究竟哪一種冷凍保護(hù)劑對豬卵母細(xì)胞更有效迄今尚未定論。

6 應(yīng)用前景

就目前看，玻璃化冷凍比程序化冷凍更具可操作性和前瞻性；而減少卵母細(xì)胞與冷源(如液氮等)的空間距離，提高冷凍降溫速度，可能是提高豬卵母細(xì)胞冷凍效率的最為有效的方法。其他技術(shù)如離心、去脂肪顆粒等也能在一定程度上提高冷凍效率，但操作繁雜，有待優(yōu)化。總的說來，為使豬卵母細(xì)胞冷凍保存實(shí)用化，開發(fā)新技術(shù)、進(jìn)一步提高冷凍效率是十分必要的。

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