腦內乙酰膽堿與認知活動的關系

摘要 腦內細胞外乙酰膽堿(ACh)的變化主要反映膽堿能神經元的活動，皮層和海馬等腦區的ACh主要來源于基底前腦膽堿能神經元的纖維投射。應用微透析等技術在體檢測清醒、自由活動動物認知過程中腦內乙酰膽堿的含量，可以研究ACh與特定行為反應和認知活動之間的關系。研究發現當機體需要對新刺激進行分析時，在學習與記憶、空間工作記憶、注意、自發運動和探究行為等認知活動中，基底前腦膽堿能神經元被激活，腦內ACh的釋放也隨之改變。結果提示腦內膽堿能遞質系統活動與認知過程密切相關。

關鍵詞 乙酰膽堿，學習與記憶，注意，自發活動量，探究行為。

分類號 B845

1 前言

乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)是中樞神經系統中第一個被測定其腦內含量的神經遞質，腦內細胞外液中ACh的變化與中樞神經系統功能的改變有著密切的關系。Bulbring等(1941)首先檢測了刺激外周神經引起的脊髓內ACh含量的變化，隨后又有研究者陸續測定認知活動過程中皮層內ACh的改變，尤其是隨著微透析等檢測技術的發展，研究清醒、自由活動動物認知過程中的腦內ACh動態變化已經成為可能。結果發現當機體需要對新刺激(獎賞或懲罰)進行分析時，基底前腦膽堿能神經元被激活，皮層、海馬等腦區內ACh的釋放隨著學習與記憶、注意、自發活動、探究行為等認知活動而發生改變。

腦內細胞外的ACh是由膽堿能神經末梢所釋放，所以細胞外ACh的水平與膽堿能神經元的活動相一致。腦內主要的膽堿能系統是基底前腦至皮層和海馬的膽堿能纖維投射。早期研究指出：刺激動物前爪、中腦網狀結構和基底核以興奮它們向皮層的投射，可同時引起感覺、運動皮層和頂葉皮層ACh釋放；隨后的一系列研究也證實大腦皮層處于激活狀態時ACh的釋放量大大高于基礎狀態。另一方面，應用電生理方法記錄神經元的活動，發現ACh的釋放量決定于神經軸突末梢內Ca²⁺濃度以及神經動作電位的頻率；反之，利用微透析技術在灌流液中給予河豚毒阻斷神經末梢的興奮后，ACh的釋放減少。以上實驗均提示細胞外ACh的變化代表了膽堿能神經元的活動狀態，而膽堿能系統向大腦皮層的興奮投射是引起皮層興奮的主要原因。

2 認知過程中腦內ACh的檢測

靜息狀態下ACh儲存在神經末梢的突觸小泡內，當動作電位傳導至神經末梢時釋放到突觸間隙，經擴散與突觸前和突觸后的M和N膽堿能受體結合，最后被膽堿酯酶水解。多數研究者采用生化、生物學和免疫組織化學方法測定腦組織勻漿中ACh的含量，但腦組織被勻漿后ACh損失很多，造成檢測的靈敏度較低：而且為了阻止ACh的分解，需用微波輻射法處死動物以迅速滅活代謝酶。為了研究認知活動過程中腦內ACh含量的動態變化，杯形技術(Cup Technique)和微透析技術(MierodialysisTechnique)先后得到廣泛應用，尤其是針對清醒、自由活動動物認知活動的研究。

杯形技術：通過在腦膜上輕微施壓后得到的液體柱來探測腦內神經遞質的含量，杯內需填充含有膽堿酯酶抑制劑的溶液以防止ACh分解，否則無法檢測。利用可以將cup植入到皮層的優點，Beani等(1968)首次在清醒、自由活動動物上測定ACh含量，而不僅僅是麻醉動物，發現動物行為反應的減少和腦電圖的抑制均與ACh的釋放減少有密切關系；反之，當動物活動增加時，伴有ACh釋放的增加。Casamenti等的研究是在產生嗎啡依賴的自由活動大鼠上進行的，發現嗎啡耐受時皮層ACh沒有變化，而納洛酮誘發戒斷時ACh含量明顯增加。杯形技術的缺點一是樣本收集困難和收集時間長，造成檢測的靈敏度較低；二是cup只能放置在皮層表面，只能研究皮層ACh的變化，不能檢測其它深部腦區ACh的含量。因此杯形技術不能研究較復雜的行為改變時腦內ACh的變化。

微透析技術：Delgado等(1972)首先提出了組織透析取樣技術(Dialytrode)，后由Ungerstedt(1974)將其進一步發展，并首次報道用于自由活動動物的在體研究中。其基本原理是在透析作用下，細胞外神經遞質水平與透析液中含量相一致。微透析技術不需要在透析液中加入膽堿酯酶抑制劑，盡管膽堿酯酶是高效的，但還是可以檢測到細胞外液中ACh的含量。Scali等(1997)測得在平靜狀態下成年大鼠大腦皮層和海馬透析液中ACh的含量分別是5.5±1.0和5.0±1.0 fmole/μL。為了減少樣本收集時間和減少ACh的分解，也可在透析液中加入膽堿酯酶抑制劑，如果加入7μM毒扁豆堿，則皮層ACh的含量是54.5±59.2 fmole/μL。目前微透析技術已成為檢測認知過程中神經遞質含量的主要方法。微透析采集的樣品量微、體積小，與高效液相色譜分析(High performance liquid chromatography，HPLC)結合起來能夠探測細胞外各種神經遞質的含量，包括ACh、胺類、腺苷、NO、多肽、氨基酸和其它內源性分子。它的優點在于不僅可以檢測皮層ACh含量，還可以檢測皮層下深部結構的ACh水平。

3 ACh與學習記憶

3.1 損毀膽堿能通路導致學習記憶損傷

基底前腦向皮層和海馬的膽堿能纖維投射是腦內最主要的膽堿能通路。早期的研究多采用機械、藥物和電損毀的方法阻斷基底前腦膽堿能神經元的投射，發現損毀后隨著ACh釋放的減少，也可誘發記憶的損傷。Flicker(1983)和Rawlms(1982)損毀隔-海馬投射導致短時記憶時目標選擇的精確性和T迷宮中操作能力的降低。Casamenti(1998)的實驗則選擇性損毀基底核，導致皮層ACh的釋放持續降低，同時伴有被動回避反應和工作記憶的降低。Kasa(1997)的實驗對膽堿能系統的損毀比較完全，當廣泛損毀基底前腦向皮層和海馬的投射后，導致認知功能的總體水平下降甚至癡呆。因此認為腦內膽堿能系統在認知功能尤其是記憶中發揮著重要作用。近期Winters和Bussey(2005)的研究也支持上述觀點。

神經免疫毒素192-IgG-Saporin可以特異性損傷核團內的膽堿能神經元，但對非膽堿能神經元沒有影響。因此，利用腦內注射192-IgG-Saporin的方法，可比前述方法更具有針對性地觀察腦內膽堿能系統的功能。側腦室注射192-IgG-Saporin的行為學研究顯示：只有損毀＞90％的膽堿能神經元后才可以產生比較可靠的行為學損傷，包括水迷宮任務的獲得、延遲匹配任務、物體辨別獲得等方面的損傷。Cahill和Baxter(2001)在基底前腦注射192-IgG-Saporin，阻斷向皮層和海馬的膽堿能投射，可導致皮層和海馬ACh釋放顯著降低，并引起學習能力和策略選擇能力的降低。Ballmaier等(2002)先在雙側基底前腦注射192-IgG-saporin，并使皮層ACh釋放量降低到探測水平以下，然后用膽堿酯酶抑制劑再將ACh水平恢復到正常水平，發現先前消失的前脈沖抑制現象又出現了。Chudasama等(2004)則通過用192-IgG-saporin損毀基底前腦和前額葉灌流M受體阻斷劑東莨宕堿這兩個途徑阻斷膽堿能神經元向皮層的投射，發現膽堿能系統損傷后不但造成記憶能力下降，而且對記憶的影響程度與任務類型有關，與注意狀態也有密切關系。以上研究均說明由基底前腦投射至皮層和海馬的膽堿能神經元在學習與記憶中發揮著至關重要的作用。

3.2 ACh與空間工作記憶

ACh是海馬的主要神經遞質，海馬主要與工作記憶有關，尤其在空間工作記憶(Spatial workingmemory)的獲得、儲存和提取中發揮重要作用，海馬在空間工作記憶中的作用要依賴于其膽堿能系統功能的完整性。Fadda(2000)發現在連續12天的放射狀迷宮任務的學習過程中動物成績的提高與海馬的ACh增加程度成正比。Chang和Gold(2003)的研究進一步證明在空間工作記憶任務的學習過程中海馬ACh升高。反之，Berger-Sweeney(2001)用免疫毒性損傷的方法選擇性損毀基底前腦膽堿神經元后，小鼠執行水迷宮空間工作記憶任務的能力下降。在臨床上，促進膽堿能神經傳遞的藥物已經被用于治療Alzheimer病人的認知損傷。最近Gr6n等(2006)的研究指出輕度認知損傷(Mild cognitiveimpairment，MCI)者認知活動能力的低下是由于其海馬膽堿能神經元的功能被抑制所致，增加海馬的膽堿能神經傳遞后，MCI者的注意、認知靈活性、口頭和空間工作記憶能力均得到改善。

膽堿能神經元對空間工作記憶的調節主要通過M受體介導，并引起突觸可塑性的改變。Van der Zee用免疫組化的方法研究發現空間任務辨別的學習可以選擇性地增加海馬CA1和CA2區的M受體數量，在皮層其它區域也觀察到M受體的增加。隨著空間記憶學習進程中發生的習慣化，突觸可塑性也發生變化，包括突觸結構和突觸傳遞相關結構的改變。Apparsundaram等(2005)的研究發現位于突觸前膜上的、負責重攝取膽堿的膽堿轉運體(Cholinetransporter，CHT)受體密度在空間學習過程中逐漸增大。以上為行為功能變化的結構基礎。

空間參考記憶和空間工作記憶是兩個不同的記憶系統，Saar等認為空間工作記憶對東莨宕堿的反應較長時參考記憶更加敏感，空間工作記憶更加依賴于腦內M受體的功能狀態。Von LinstowRoloff等(2007)進一步研究發現東莨宕堿(1mg/kg)可以嚴重損傷動物在延遲位置匹配任務(Delayedmatching to position，DMTP)中的空間工作記憶，甚至當劑量降至0.2mg/kg時同樣損傷空間工作記憶，但是對空間參考記憶沒有影響。因此東莨宕堿可以分別不同程度地干擾空間工作記憶和空間參考記憶的獲得及提取過程。Chang和Gold(2003)檢測腦內ACh的含量，發現在空間學習過程中海馬和紋狀體ACh的釋放過程是不同步的，首先被激活的是海馬，與空間工作記憶中的空間位置的獲得有關；后被激活的是紋狀體，此時海馬也保持在激活狀態，空間工作記憶的反應應答與兩者的共同作用有關。腦內膽堿能系統從海馬到紋狀體的順序激活標志著從陳述性學習到程序性學習的轉換。

4 ACh與注意

關于腦內膽堿能系統對注意過程影響的研究多采用腦內損毀的方法，多數報道認為可干擾注意加工，但因為實驗中注意過程很難與學習記憶等其它認知過程完全分離，所以結果極具復雜性。最早的研究是Stoehr(1997)用192-IgG-saporin損毀基底前腦膽堿能神經元，隨后Chudasama等(2004)也進行了類似的研究，分別用192-IgG-saporin損毀基底前腦和用東莨宕堿灌流前額葉，觀察對視空間任務的學習、記憶以及注意的影響，發現腦內膽堿能系統損毀后，根據學習任務中注意加工程度的不同，對注意和記憶產生不同的損傷，兩者產生了分離。另一方面，Sarter等(2005)通過激活基底前腦至皮層的膽堿能傳入可加強與記憶相關的注意加工過程。微透析檢測的結果是簡單操作任務時皮層ACh增加，尤其在早期獲得期最顯著，即需要注意加工的時期。Orsett(1996)等的研究就檢測到在獎賞性操作行為的獲得期皮層和海馬ACh釋放增加，而不是回憶期。最近Parikh(2007)進一步發現大鼠在執行視覺注意任務時，內側前額葉皮層(Medial prefrontal cortex，mPFC)ACh釋放增加。但是Passetti(2000)認為執行困難任務時的注意努力與ACh的釋放之間并不是總存在對應關系。Sarter(2007)的最新研究認為刺激的注意加工過程與學習程度之間關系復雜，基底前腦膽堿能系統主要影響的是基本注意過程而不是學習；而且投射到前額葉和頂葉后部的膽堿能神經元的作用也不同，前者主要與刺激的注意加工過程有關，后者主要與學習程度有關。

5 ACh與自發活動

自發活動量(Locomotor activation)反映行為喚醒程度，關于自發活動量與ACh釋放之間的直接關系的研究出現不同結果。多數研究認為動物認知過程中自發活動量的增加與ACh的升高有關。Watanabe(1990)首先發現紋狀體的ACh釋放與自發活動量有關，Day的研究結果也認為大腦皮層、海馬和紋狀體ACh的釋放與自發活動量有直接關系。但是也有人不支持這種觀點。Giovannini(2001)認為前腦和海馬ACh釋放與第一次暴露于新穎環境時的自發活動量沒有關系，但是60min后動物第二次暴露于相同環境時，引起動物習慣化，此時ACh釋放與自發活動量有關?？梢娗澳X和海馬ACh的釋放與幾個因素共同相關，自發活動量只是其中之一，其它因素如注意、喚醒、焦慮和應激等均可引起腦內ACh的釋放改變。幾種功能均與ACh釋放有關的現象可以解釋前述的矛盾結果，自發活動量與ACh釋放的關系根據所研究的區域、喚醒水平、注意水平、行為表現的不同可以出現不同的結果。

Mizuno等(1991)發現海馬ACh的釋放規律還與覺醒一睡眠等生物節律呈現一致性。在鼠等夜行動物中，隨著其夜間活動量的增加，海馬ACh的釋放也隨之升高。Mitsushima(1998)的研究結果與其一致。如果應用基因突變的方法使大鼠的體溫、自發活動量和睡眠節律較前延遲2小時，則海馬ACh釋放增加的出現也推遲2小時出現，說明海馬膽堿能神經元的功能受生物節律的調節。最近Takase(2007)等用微透析方法24小時同時檢測運動前區ACh的釋放、基底大細胞核(Nucleus basalis magnocellularis，NBM)膽堿能神經元的數量以及自發活動量這三個指標，以進一步確定三者之間的關系。發現ACh釋放呈現24小時節律，夜間高白天低，與自發活動量的變化保持同步，進一步驗證了Mizuno的結果。另外他們首次報道ACh的釋放還表現出性別差異，雌性大鼠較雄性ACh釋放量更大而且NBM核的神經元數量也更多，因此認為運動前區ACh的釋放與運動的性別差異有關。

6 ACh與探究行為

關于前腦和海馬的膽堿能神經元與新穎環境下探究行為的關系首先得到電生理學研究的證實。Gray和McNaughton(1983)記錄到動物處于新穎環境下時，海馬神經元出現e節律，而海馬e節律是皮層一海馬膽堿能通路被激活的表現。在行為學研究方面，Inglis和Fibiger(1995)指出視覺、嗅覺、聽覺和觸覺等方面的新穎刺激均可增加皮層和海馬ACh的釋放并引發一系列相應的行為改變，而且各種刺激引起的海馬ACh升高程度是相同的，并不具有特異性。因此膽堿能遞質系統的改變是對各種新穎刺激發生的反應，并不是針對不同的刺激類型。Acquas(1996)進一步研究了刺激和膽堿能系統反應的關系，發現在恐懼條件反射形成實驗中，當用聲音和光線刺激作為條件刺激時，可顯著增加ACh在額葉皮層和海馬的釋放。但當反復給予聲音和噪音刺激8天并使動物形成習慣化后，不再引起ACh釋放的增加。Giovannini(2001)著重比較新穎性高低引起ACh改變的不同：如果動物在新穎環境中僅僅停留2rain，則皮層ACh增加150％～200％：停留時間超過30min，則皮層ACh增加幅度下降。另外，第一次暴露在新穎環境時，皮層和海馬ACh的釋放分別增加64％和200％；而第二次處于新穎環境時，皮層和海馬ACh的釋放增加分別降至37％和51％。Bianchi和Giovarmini(2003)在前述基礎上進一步觀察了其它遞質系統與新環境中探索行為之間的關系，發現當大鼠第一次暴露于新穎環境時，前10min內海馬除了ACh升高以外，谷氨酸、天門冬氨酸也較前升高，GABA則在10min后開始升高。而第二次處于相同環境時，各種遞質水平的升高均較前降低。因此新環境中的探究行為受ACh、谷氨酸、天門冬氨酸和GABA遞質系統的協同調節。

反之，Ricceri(2003)用192-IgG-saporin損傷新生大鼠膽堿能系統，大鼠成年后在空間新環境下的探索能力下降。Michael(2007)最近具體研究了海馬CA3區至隔區的投射和隔區至海馬CA3區膽堿能投射之間的關系，結果是CA3區灌流東莨宕堿后，動物在空間和非空間新環境下的探索能力均下降，選擇性切斷CA3區至隔區的傳出纖維，也得到類似結果；相反灌流膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿則使之增強。說明膽堿能系統調節海馬的信息編碼、儲存、提取過程，并且CA3區和隔區存在相互作用，CA3區通過影響隔區投射至海馬的膽堿能傳入來調節信息編碼。

除了環境因素，新的味覺刺激也可引起島葉ACh的釋放增加。已經證實島葉在味覺信息的編碼過程中有重要作用，應用東莨宕堿阻斷島葉的M受體可阻斷對味覺的編碼。Miranda等(2000)在大鼠的飲水中加入糖精，當第三次給予時島葉ACh的釋放不再增加，當用奎寧代替糖精作為新穎刺激時，又出現新的ACh釋放高峰。但這個實驗沒有確定是否味覺也可以激活海馬及其他皮層區域ACh的釋放，而不僅僅是在味覺代表區。

7 小結

綜上所述，腦內ACh與認知活動之間關系復雜。在學習與記憶、注意、新環境下的探究行為和自發活動等各種認知活動中，腦內ACh多呈現同步升高的趨勢，但是也有不同的結果。各種認知活動中腦內ACh的改變主要表現在皮層、海馬等腦區，它們主要接受來自基底前腦的膽堿能纖維投射。雖然不同的認知活動也可以引起某些特定相關腦區ACh的升高，但是這方面的研究證據尚不充分。另外，腦內ACh的改變還與認知過程中不同的信息加工環節和模式有關。

目前在研究清醒、自由活動動物ACh的動態含量時方法學上尚存在一定限制。因為微透析技術應用高壓液相分析腦內ACh的含量時需要的采集時間是5rain，但認知活動中信息的獲得和行為的改變通常發生在數秒內，在5min的透析液收集期間所發生的一切是無法全部探測到的。這種時間上的差距造成無法精確確定腦內ACh變化和特定認知活動之間的動態對應關系。

盡管研究者們從不同的角度對腦內ACh與認知活動的交互關系進行了考察，但這些研究彼此之間并不是完全獨立的，而是彼此之間有著密切的聯系，對一些問題的探討也往往伴隨著另一些基本問題的探討，如在ACh與學習記憶關系的研究中，實際上往往涉及到了注意、新環境刺激等對ACh的影響。因此在今后的研究中一個可行的研究方向是將這些相關的問題有機地結合起來進行研究，進而揭示ACh與認知活動關系的實質。