對狗魚不同組織同工酶的研究

摘要：本文采用聚丙烯酰胺垂直板電泳法研究了狗魚肌肉、心臟、肝臟、腦和眼睛等5種組織的超氧化物脫氫酶（SOD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）酶譜。試驗結果表明：狗魚不同組織的SOD酶譜具有明顯的組織特異性，每種組織的酶帶4～7條不等；狗魚不同組織的蘋果酸脫氫酶共檢測到4條酶帶；狗魚不同組織的乳酸脫氫酶共檢測到8條酶帶。

關鍵詞：狗魚；不同組織；超氧化物脫氫酶（SOD）；蘋果酸脫氫酶（MDH）；乳酸脫氫酶（LDH）

狗魚（Esox americanus Gmelin）屬鮭行目，狗魚科，狗魚屬，即黑斑狗魚。俗稱：狗魚、鴨魚。體細長、稍側扁；口裂極寬大，約為頭長的一半；齒發(fā)達；背鰭及臀鰭位很后并相對；體側有斑。狗魚在產(chǎn)區(qū)的天然產(chǎn)量很大，肉質細嫩潔白實不亞于鯉、鯽或大麻哈魚。

狗魚是在北半球寒帶到溫帶里廣為分布的淡水魚。狗魚性情兇猛殘忍，行動異常迅速、敏捷，每小時能游8公里以上。狗魚以魚類為食，食量大，冬季仍繼續(xù)強烈索食，尤以生殖后食欲更旺。通常在清晨或傍晚獵取食物，其它時間則不再游動，而是靜下來休息，并慢慢地消化所吞食的食物，狗魚捕食時異常狡猾。

同工酶電泳技術作為一種實用的生化遺傳學研究手段之一，業(yè)已廣泛應用于魚類的物種及雜種鑒定、物種間親緣關系比較及系統(tǒng)分類、基因連鎖與基因作圖、遺傳育種、胚胎發(fā)育過程中的基因表達與調空等方面的研究[1]。本實驗應用聚丙烯酰胺垂直板電泳法對狗魚的肌肉、心臟、肝臟、腦和眼睛等5種組織的超氧化物脫氫酶（SOD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）進行初步研究，探討其同工酶的酶譜表現(xiàn)模式及遺傳基礎的亞基組成，為狗魚的組織特異性及生化遺傳研究提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1實驗樣品的采集

本研究于2005年9月共采集了來自達賚湖漁場的天然野生狗魚30尾，均為健康正常個體。體長25～30cm，體重500～~600g。

每尾魚取樣前先剪斷魚鰓動脈，放血，活體解剖，肌肉取背鰭后最豐滿處的白肌1～2g，肝臟取1～2g，心臟、眼球及腦取全部。用生理鹽水在0℃條件下洗去組織污血，稱重后放入已編號的凍存管，于液氮中保存。運回實驗室后，放在-40℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣品制備

肌肉樣取0.3g，以1：3的比例（重量g：體積ml）加入0.3% 的 NAD液，于勻漿機中勻漿2min，粉碎組織。用吸管將勻漿后的樣品移入冷凍離心管中，在冷凍離心機中以17000r/min 4℃離心20min，最后將離心后的上清液移入到另一個的冷凍離心管中供電泳分析用。肝臟樣取0.3g，以1：4的比例（重量g：體積ml）加入0.3% 的 NAD液，勻漿，12000r/min 4℃離心兩次，第一次離心后，去除上層的油膜，第二次離心，至上層溶液澄清為止。其它組織樣品的制備方法同肌肉樣。將制好的樣品按4：1比例與指示劑混合，之后放入4℃冰箱備用。

1.3同工酶測定方法

染色液及脫色液和固定液參照胡能書等[2]，以溴酚蘭為指示劑。電泳采用的是垂直板聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）方法[3]。已染色的膠條用數(shù)碼攝像機進行拍片，保存圖片，然后用Photoshop7.0的圖象處理軟件對其圖形進行分析。

1.4結果記錄

同工酶的縮寫、基因座位和等位基因的命名基本參照Shaklee[3]和Whimore[4]方法。以同工酶縮寫名稱的大寫代表酶蛋白，小寫代表編碼基因。控制同一種酶的不同基因座位按照從陽極到陰極的順序依次標記為1、2、3……

2結果與分析

2.1超氧化物歧化酶[Superoxide dismutase（SOD)]

狗魚不同的組織SOD酶譜具有明顯的組織特異性（圖1）。共檢測到7條酶帶，每種組織的酶帶4～7條不等。肌肉中有m-SOD-4、s-SOD-1、 s-SOD-2和 s-SOD-3等4種帶型，其中m-SOD-4和s-SOD-1的活性很強；心臟中有ｍ-SOD-1、ｍ-SOD-2和ｍ-SOD-4等3種帶型，它們的活性較弱；肝臟中的帶型和心臟一致，但ｍ-SOD-1在肝臟中的活性很強；腦中存在ｍ-SOD-1、ｍ-SOD-2、ｍ-SOD-3、m-SOD-4等4種線粒體型，m-SOD和s-SOD-1帶型；眼睛中存在ｍ-SOD-1、ｍ-SOD-2、ｍ-SOD-3 和m-SOD-4等4種帶型，而不存在細胞質型。SOD在各組織中的表達強弱如表1所示。

2.2蘋果酸脫氫酶[malate dehydrogenase（MSH）]

狗魚不同組織的蘋果酸脫氫酶共檢測到4條酶帶（圖2）。每種組織有1～4條不等。肌肉中只有1條，即為m-MDH；心臟中有m-MDH和s-MDH-3等2條帶型；肝臟與眼睛的帶型一致，都為s-MDH-1、s-MDH-2和s-MDH-3，但其表達強弱不一致，在肝臟中的表達較強；m-MDH、s-MDH-1、s-MDH-2和s-MDH-3等4條帶型在腦中都有表達。MDH在各組織中的表達強弱如表2所示。

2.3乳酸脫氫酶[lactate dehydrogenase（LDH）]

狗魚不同組織的乳酸脫氫酶共檢測到８條酶帶（圖３）。每種組織有1～7條不等，腦中的最多為7條，肝臟中最少為1條。眼睛和心臟具有相同的帶型，都有LDH-7和LDH-6。LDH-8在肌肉中的活性較強，各組織的帶型如下：眼睛和心臟中存在LDH-7和LDH-6兩種帶型，但這兩種帶型在心臟中的表達較強；腦中存在LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5、LDH-6和LDH-7等7中帶型；肝臟中存在LDH-7帶型；肌肉中存在LDH-7和LDH-8等2條帶型。LDH在各組織中的表達如表3所示。

3討論

3.1關于狗魚同工酶的組織特異性

同工酶是基因表達的產(chǎn)物，不同的同工酶與基因的關系不同。如過氧化物酶由單基因決定，乳酸脫氫酶由多基因決定；同工酶的表現(xiàn)形式還與生物的發(fā)育、進化、組織生理、基因的表達調控有關。目前研究表明，同工酶在硬骨魚類中具有明顯的組織特異性[5]。同工酶的組織特異性與組織生理功能相關。同工酶在同一生物體內(nèi)的不同組織之間由于生物功能的不同而存在差異。本實驗結果表明：SOD在狗魚各組織中存在明顯的組織特異性；MDH在狗魚的肌肉、心臟、和腦中存在明顯的組織特異性，而在肝臟和眼睛中不存在組織特異性；LDH在狗魚的眼睛、腦和心臟中存在明顯的組織特異性，而在肝臟和肌肉中不存在組織特異性。

3.2關于酶的遺傳基礎

SOD為二聚體酶，一般有ｓ-SOD和m-SOD兩種類型[6]。通過17%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測狗魚5種組織的SOD。狗魚的SOD也存在有相互不形成異聚體的細胞質型s-SOD和線粒體型m-SOD兩部分，s-SOD形成典型的二聚體3條酶帶，其基因型可能分別為ｓ-SOD（Ａ2）、ｓ-SOD（AB）、ｓ-SOD（Ｂ2）[7]。m-SOD有４條酶帶，各酶帶的遷移率一致，但活性不同。

一般來說，魚類在肌肉組織中存在兩類MDH，有4個基因座位編碼，有細胞質型（s-MDH）和線粒體型（m-MDH）[8]。本實驗通過8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測出狗魚5種組織的MDH為二聚體酶，有移動較快的細胞質型（s-MDH）與移動較慢的線粒體型（m-MDH）。m-MDH只形成同二聚體，肝臟、腦組織和眼睛中的s-MDH都形成典型的二聚體3條酶帶（如圖2所示），其基因型為s-MDH（B2）、s-MDH(AB)和 s-MDH(A2)，但各組織的活性不一致。其中m-MDH在肌肉、心臟和腦組織中都表達，只是活性強弱不同，在腦組織中活性最強。s-MDH除在肌肉中不表達，在心臟中只表達s-MDH-3，在肌肉、心臟、肝臟中三條帶都表達，肝臟中表達活性最強，肌肉中最弱。

LDH為四聚體。對魚類的LDH同工酶的研究，前人已作過了許多工作。硬骨魚類都有Ａ、Ｂ、Ｃ３個位點，二倍體硬骨魚類中的Ａ、Ｂ位點普遍存在于各組織器官中；Ｃ位點的器官分布，隨魚的不同而不同，常見于眼睛、肝臟等組織[9]。本實驗通過7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測狗魚5種組織的LDH，結果表明狗魚的五種組織都具有LDH酶活性，共檢出8條帶，酶譜多于LDH典型的5條帶。達賚湖狗魚的LDH按遷移率分為LDH-1、2、3、4、5、6、7、8。上述結果由于實驗方法不同，也許與其他研究人的研究結果不太一致 。

參考文獻

[1] 王宏偉，王安利，王維娜，等魚類同工酶研究進展[J].動物學報，2001，47(專刊):101 - 105.

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[3] Shaklee J B，Allendor F W，Morizot D C，etal.Genetic Nomenclature for protein-Coding Loci in Fish [J].Trans Am Fish Soci，1990.119:2-15.

[4] Whitmore. Electrophoretic and isoelectric focusing technique in fisheries management [M].Boston:cpc press，1990.28-30.

[5] 黃海，尹紹武，張本，等.奧尼羅飛魚5種組織中4種同工酶的研究. 南方水產(chǎn)，2006，1:11 - 17.

[6] 潘峰，胡枚，王和海.奧利亞羅飛魚血蛋白和組織同工酶電泳圖譜的特異性研究[J].淡水漁業(yè)，1993，23(2):7 - 10.

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