一種簡單快速的赤霉病菌單孢分離方法

張　昊　張　爭　許景升　徐　進(jìn)　張麗勍　潘哲超　田　茜　馮　潔

摘要本文對瓊膠平板稀釋純化法進(jìn)行了改良，建立了一種新方法一平板稀釋畫線分離法，既保留了其簡單快速，操作方便，易于掌握的優(yōu)點(diǎn)，又解決了可靠性差的缺點(diǎn)，適用于一些不易直接挑取的體積較小，顏色較淡的真菌孢子，如鐮刀菌等，和傳統(tǒng)分離方法相比節(jié)約了大量時間，適合大量樣品的分離純化。

關(guān)鍵詞真菌；單孢子；分離

中圖分類號S 432.1

由鐮刀菌引起的赤霉病是世界潮濕、半潮濕地區(qū)麥類作物的一種重要病害，近年來在北美迅猛擴(kuò)展，在歐洲和南美地區(qū)也呈蔓延趨勢。在我國小麥赤霉病在北方地區(qū)已經(jīng)上升為小麥的主要病害。鐮刀菌不僅侵染作物造成產(chǎn)量損失，而且侵染谷物籽粒后產(chǎn)生的真菌毒素對人畜健康造成嚴(yán)重威脅，因此，科研工作者對其十分重視。研究鐮刀菌群體遺傳結(jié)構(gòu)、性征和同宗或異宗配合等生理現(xiàn)象，都要求菌種由單個孢子分離繁殖而來。所以，建立一套簡便高效的單孢子分離技術(shù)，能夠節(jié)省大量的時間，有利于后續(xù)工作的進(jìn)行。目前常用的分離方法主要有：瓊膠平板稀釋純化法、瓊膠平板表面單孢子挑取法、眉毛挑針法，固定昆蟲針挑取法，鉛筆柄挑孢針挑取法等，它們各有利弊。筆者在短時間內(nèi)進(jìn)行大量鐮刀菌單孢子分離的過程中，通過試驗(yàn)對瓊膠平板稀釋純化法進(jìn)行了改良，建立了平板稀釋畫線分離法，提高了此方法的可靠性，這種方法的分離效率高，適合大批量樣品的單孢子分離。

1材料與方法

1.1樣品

病組織樣品為采自全國12個省份具有典型癥狀的小麥赤霉病病穗3545個。

1.2試劑與儀器

超凈工作臺、顯微鏡、Eppendorf Mix Mate渦旋振蕩器、Eppendorf移液器、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、載玻片、PCR管、無菌水、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉、醫(yī)用氯霉素。

1.3方法

1.3.1孢子出現(xiàn)幾率統(tǒng)計

用移液器將PCR管裝入100μL無菌水，剝?nèi)“l(fā)病小穗最外面穎殼在無菌水中輕輕蘸浸一下，渦旋混勻，吸取1μL于載玻片，15×10倍顯微鏡下鏡檢，并稀釋至孢子量約1個／μL。取稀釋后孢子懸浮液2.0μL于載玻片，顯微鏡下鏡檢計數(shù)，重復(fù)200次。

1.3.2制備適宜濃度孢子懸浮液

取小麥赤霉病的病穗穎殼在裝有無菌水的PCR管(可用1.5mL或2mL的微量離心管)中輕輕蘸浸一下。取1μL鏡檢，稀釋至孢子含量1個／μL。

1.3.3 PDA培養(yǎng)基平板的制備

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，醫(yī)用氯霉素40mg，121℃高壓滅菌20min。

在超凈工作臺內(nèi)將培養(yǎng)基倒入滅菌平板，待平板內(nèi)培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板底部用記號筆畫5條平行線(圖1)。

1.3.4畫線

在超凈工作臺內(nèi)，用10μL移液器吸取2μL配置好的孢子懸浮液，沿著平板底部的一條直線在培養(yǎng)基上均勻畫線，重復(fù)5次。注意，盡量不要用槍頭劃壞培養(yǎng)基。

1.3.5恒溫培養(yǎng)

將畫線的平板放入培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)30h，直到可以看見沿著直線長出微小的菌落，大多1條線1～2個或無菌落，極少出現(xiàn)3～5個菌落的現(xiàn)象。

1.3.6單菌落的轉(zhuǎn)移

選取1條線只長出1個的菌落或1條線上相隔較遠(yuǎn)的2個菌落，距離較近的2個菌落和1條線上長出多個的菌落則舍棄，選取菌落部位的底部用記號筆做標(biāo)記，在超凈工作臺內(nèi)，將標(biāo)記處培養(yǎng)基切下，轉(zhuǎn)移至新的PDA平板中，28℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.7菌落形態(tài)鑒定

培養(yǎng)3d后，觀察PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，進(jìn)行鑒定，去掉鑒定為非赤霉病菌的菌株。

2結(jié)果與分析

2.1孢子出現(xiàn)幾率統(tǒng)計

對200次顯微鏡計數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，2μL孢子懸浮液中出現(xiàn)1個孢子的幾率為50％，無孢子出現(xiàn)的幾率為35％，出現(xiàn)2個孢子的幾率為12％，3～5個孢子的幾率為3％(圖2)。

2.2平板稀釋畫線分離菌株

從3545個小麥赤霉病穗中分離到4000株小麥赤霉病菌，總污染率1.96％，分離到非赤霉病菌32株，占0.8％，總的單孢子分離成功率為97.24％。

3討論

影響瓊膠稀釋平板法可靠性的主要因素為孢子懸浮液的濃度，濃度過高，多個孢子聚集在一起的幾率較大，不能確定一個菌落是從單個孢子繁殖而來；而濃度過低可能長不出菌落。預(yù)試驗(yàn)確定了在孢子濃度為1個／μL時，每2μL孢子懸浮液中出現(xiàn)1個孢子的幾率達(dá)到50％，而無孢子的幾率為35％，這樣單菌落由單孢子繁殖而來的可靠性就達(dá)到85％，只需繼續(xù)改良試驗(yàn)方法，最大限度地排除出現(xiàn)2～5個孢子的15％情況即可得到可靠的單孢子分離物。

目前單孢子分離技術(shù)中廣泛應(yīng)用的主要有兩種方法：瓊膠平板稀釋純化法、瓊膠平板表面單孢子挑取法。其中，直接挑取法雖然得到的單孢子可靠，但操作復(fù)雜，難度大，較為費(fèi)時費(fèi)力，不適合大量樣品的分離，而且此方法更適用于體型大、有色、多細(xì)胞的真菌孢子如銹菌孢子，而鐮刀菌的分生孢子無色透明，隔著平皿在顯微鏡下反差很小，用此方法分離難度很大。瓊膠平板稀釋純化法操作簡便快速，初學(xué)者也易于上手，但是由于這種方法實(shí)質(zhì)上是分離菌落，不能看到和確定一個菌落是從單個孢子繁殖而來，純化的可靠性較差。

作者所建立的平板稀釋畫線分離法，保留了瓊膠平板稀釋純化法的優(yōu)點(diǎn)，方法簡單，初學(xué)者不用培訓(xùn)均可熟練掌握，分離效率高，適合各種類型真菌孢子的分離，尤其適合大量樣品的單孢子分離。另外，通過單孢子出現(xiàn)幾率的統(tǒng)計試驗(yàn)大大提高了平板畫線的科學(xué)性，直接得單孢子繁殖菌落的幾率達(dá)到85％，同時作者采用平板畫線的方法，將2／xL孢子懸浮液涂成一條直線，試驗(yàn)證明如果含有2個孢子，也大多能夠分散開，形成單獨(dú)的2個菌落，將極少出現(xiàn)的一條線上2個或多個菌落重疊的情況舍棄，保證了得到單孢子菌落的可靠性。由于每2／xL孢子懸浮液中不含孢子的幾率也達(dá)35％，作者采取在每個平板畫5條線的方法增大孢子出現(xiàn)幾率，在實(shí)際應(yīng)用過程中，很少出現(xiàn)不長菌落的平板。

常規(guī)的赤霉病菌分離方法需要首先將病粒或穗軸用乙醇或次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，放入PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，3d后取初分離物放入CLA培養(yǎng)基，日光燈和365nm近紫光燈12h光暗交替的組培架上誘導(dǎo)產(chǎn)孢，10d后產(chǎn)生大型分生孢子，或挑取初分離菌絲體至綠豆湯培養(yǎng)基中，26℃、120r／min振蕩培養(yǎng)3d誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子，之后進(jìn)行單孢子分離。作者采用病穗穎殼直接在無菌水中蘸浸的方法得到孢子懸浮液，比傳統(tǒng)方法節(jié)約時間6～13d，大大提高了工作效率。但直接從病組織上獲取孢子，畫線平板可能會少數(shù)出現(xiàn)細(xì)菌污染，因此需注意對單孢子轉(zhuǎn)移純化時的無菌操作，注意舍棄污染的菌落，并且在轉(zhuǎn)移單孢子的PDA培養(yǎng)基中加入醫(yī)用氯霉素來抑制細(xì)菌生長(畫線平板不加抗生素，否則可能會影響孢子萌發(fā)率)，取得了很好的效果，筆者用此方法大量分離鐮刀菌，污染率小于2％。

本方法還需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)時間，在菌落微小的時候及時觀察并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基，否則菌落長大后，距離較近的兩個菌落難于區(qū)分，影響方法的可靠性，禾谷鐮刀菌在30h為宜，最長不能超過36h。

本方法步驟簡單、分工明確，適合實(shí)驗(yàn)室多人合作，能夠顯著提高分離效率，筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用稀釋平板畫線法在短時間內(nèi)完成了采自全國各地3500余個小麥赤霉病病穗的單孢子分離，其高效性得到了很好的體現(xiàn)。