大鼠骨髓間充質干細胞與成纖維細胞差異蛋白質組學研究

[摘要]目的：進行大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）與成纖維細胞（FBs）細胞的蛋白質組學研究，尋找出重要的差異蛋白質。方法：采用二維電泳的方法（2DE）分別分離兩種細胞的蛋白質，用PDQuest軟件分析蛋白表達差異，并采用質譜(MALDI-TOF-MS)進行鑒定。結果：發現了MSCs和FBs之間存在差異表達的15種蛋白質，其中4種蛋白質差異顯著且與細胞功能密切相關，即SM22-α、鳥嘌呤脫氨基酶（Guanine deaminase，GD）、膜聯蛋白（Annexin A5）、過氧化物岐化酶-2（superoxide dismutase 2，SOD-2）。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表達分別比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表達分別比FBs高16倍和21倍。結論：與大鼠FBs相比，MSCs存在更多防止細胞損傷相關的蛋白質和更少的與細胞衰老過程密切相關的蛋白質，具有高分化潛能，更適合于作為組織工程種子細胞。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；成纖維細胞；蛋白質組學

[中圖分類號]Q831[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）07-1021-05

Comparative proteomic analysis of mouse mesenchymal stem cells and skin-derived fibroblasts

SUN Yang1，ZHAO Liang2，WEI Xu-feng2，YI Wei2，GUO Shu-zhong1

（Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi，China）

Abstract:ObjectiveTo analysis and to compare the proteomic differences between mesenchymal stem cells(MSCs) and fibroblasts(FBs)， and to discover the key different proteins.MethodsSeparate the protein of cells by 2 dimension electrophoresis（2DE）， analysis the differences of protein expression with PDQues， and identify with MALDI-TOF-MS. ResultsDiscover fifteen different types of proteins， four of which associate with different functions of MSCs and FBs. Those are SM22-alpha， Guanine deaminase(GD)， Annexin A5 and superoxide dismutase 2 (SOD-2). the expression of SM22-αand Annexin A5 in MSCs is separately 26 folds and 8 folds lower than in FBs， but MSCs express GD and SOD2 16 folds and 21 folds higher than FBs.ConclusionCompared with FBs， MSCs express more kinds of proteins that can prevent the damage of themselves， while have fewer proteins associated with aging in expression. Plus pluripotent differentiation potential， they are better seed cells for tissue engineer.

Key words: mesenchymal stem cells; fibroblasts; proteome

骨髓間充質干細胞（MSCs）與成纖維細胞（FBs）都可作為組織工程種子細胞，兩者都具備分泌細胞外基質的能力，且MSCs可在一定條件下誘導分化為FBs。然而，MSCs具備生長和分化的能力，FBs卻不具備分化潛能。本研究從蛋白質組水平比較MSCs與FBs蛋白表達的差異，試圖找到使MSCs具備分化潛能的關鍵蛋白質，深入了解導致MSCs與 FBs不同功能的結構基礎，為進一步深入研究和改建 MSCs成為具有完全功能的組織工程種子細胞打下基礎。

1材料和方法

1.1 試劑、儀器及動物

1.1.1 試劑： DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)、EDTA鈉、肝素鈉、Percol1分離液均購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自四季青公司；CD34，CD29，CD45和FITC標記的二抗均購自美國SantaCruz公司；溶液均由Milli-Q水配制而成；其它試劑均為分析純。

1.1.2 儀器：二維電泳系統及PDQuest凝膠分析軟件購自美國Bio-Rad公司；Powerlook 2100XL凝膠圖像掃描儀購自美國UMAX公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)購自德國。

1.1.3 動物：SD大鼠子鼠，雄性，年齡 16～17天，購自第四軍醫大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的分離與培養：選用雄性SD大鼠子鼠，用體積分數為3.5％的水合氯醛腹腔注射麻醉。分離出四肢骨，用DMEM培養基沖洗骨髓腔。將沖洗獲得的溶液以300g/min的速度離心5min。棄上清液，再用培養基重懸沉淀，加入到梯度Percoll液中，以900g/min的速度離心20min。吸取交界面處云霧狀層，用含質量分數為10％FBS的DMEM培養基重新懸浮，以300g/min的速度離心5min，棄上清液，置于培養瓶內接種，培養。24～48h后更換培養液，棄去未貼壁細胞。5～6天消化分瓶傳代培養。

1.2.2 大鼠FBs的分離與培養：處死大鼠，用75％酒精浸泡3～5min，切取2cm×3cm大小背部皮膚2塊，用PBS緩沖液清洗2～3次。然后將其切成長約1cm寬0.3～0.5cm左右的皮條。用濃度為2.4U/mlDSP酶在37℃消化1～1.5h左右，撕去表皮層，將真皮層剪成約1mm3的碎塊，移入5ml膠原酶，在37℃培養箱中消化1～1.5h，每20min左右振蕩，消化到組織塊散開為止。加培養液稀釋膠原酶，用吸管吹打，再用100目的鋼網過濾，祛除剩余的組織塊。收集細胞懸液，以300g/min的速度離心9min，細胞記數，以2×105/ml的細胞量接種，置于培養箱中培養。

1.2.3 MSCs表面抗原的鑒定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收獲第3代細胞，其分別與抗CD29，CD34，CD45的單克隆抗體飽和溶液在室溫下反應30min，然后用PBS洗滌2次，再與FITC標記的二抗避光作用15min。最后用PBS洗滌并重懸于PBS中，對MSCs表面抗原進行流式分析。

1.2.4 蛋白分離及圖像分析：消化分離出細胞，在4℃以3 000r/min的速度離心10min，棄去上清液，加入預冷的PBS洗滌3次。在裂解液中重懸細胞，在冰浴冷卻下超聲破碎細胞。分別加入脫氧核糖核酸酶200ml和核糖核酸酶50mL，于4℃放置15min，以12 000r/min的速度離心30min。收集上清液，用Bradford法測定蛋白含量，在-80℃中保存蛋白樣品。采用2DE方法分離細胞蛋白提取物。

1.2.5 質譜分析及數據庫檢索：對蛋白點膠內酶切，提取多肽混合物。用MALDI-TOF-MS法(Voyager-DE)檢測蛋白多肽。采用moverz軟件對多肽質譜進行校正，通過peakErazor軟件去除各種污染，如胰酶自降解峰以及角蛋白污染峰等。采用不同的檢索引擎(Aldente， Profound， MS-Fit)對兩種不同的數據庫(NCBInr和Swiss-Prot)蛋白進行數據檢索[1]。

2結果

2.1 MSCs和FBs形態觀察：MSCs和FBs形態相似，均呈梭形貼壁生長（圖1）。

2.2流式細胞儀對大鼠MSCs表面抗原鑒定結果：大鼠MSCs表面抗原 CD29呈陽性，而CD34和CD45呈陰性，表明實驗所用細胞為MSCs，并且在增殖過程中能夠保持其特征。可排除造血干細胞的污染（圖2）。

2.3 特征蛋白的鑒定：采用pH=3～10的IPG膠條分離MSCs和FBs蛋白提取液，結果見圖3。PDQuest軟件分析MSCs和FBs蛋白點變化情況。結果表明：MSCs與FBs表達的蛋白質譜很相似，但仍存在差異。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白點有3個，MSCs多而FBs少的蛋白點有5個，MSCs少而FBs多的蛋白點5個，MSCs沒有而FBs有的蛋白點有2個。這些蛋白點將作為質譜分析的對象進行膠內酶解及質譜分析，成功地鑒定出4個有意義的蛋白點，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表達分別比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表達分別比FBs高16倍和21倍。4個蛋白點的肽質量指紋圖譜如圖4所示。

3討論

FBs曾作為組織工程種子細胞，但其功能存在缺陷。MSCs是一種多能干細胞，具有自我增殖和多向分化的潛能，目前認為其作為組織工程種子細胞有很好的應用前景。在一定條件下，MSCs可誘導分化為FBs，但MSCs與FBs的蛋白組學功能差別的分子結構基礎，尚未見深入研究報道。本試驗對大鼠MSCs和FBs研究發現這兩種細胞形態相似，均呈梭形，并均貼壁生長。MSCs表面抗原CD29為陽性，CD34和CD45為陰性。本研究進一步對兩種細胞進行蛋白分離和蛋白組學比較研究，發現MSCs與FBs表達的蛋白質譜很相似，但仍存在差異。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白點有3個，MSCs多而FBs少的蛋白點有5個，MSCs少而FBs多的蛋白點5個，MSCs沒有而FBs有的蛋白點有2個。將這些蛋白點作為質譜分析的對象進行膠內酶解及質譜分析，成功地鑒定出4個有意義的蛋白點，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。細胞蛋白表達上的差異，導致了兩種細胞具有不同的功能，通過蛋白質組的鑒定，我們發現以上四種主要差異的蛋白質均與MSCs保持高度增殖和分化能力有關。

SM22-a可在多種間質細胞中表達[2]，與細胞的衰老有關，分化程度越高的細胞表達SM22-a越多[3]。蛋白質組的研究結果顯示MSCs與FBs相比SM22-a表達少，說明MSCs分化程度較低，是更年輕的細胞，具備高分化潛能。GD是核苷酸代謝的關鍵酶，催化水解的脫氨基作用，使鳥嘌呤轉化為黃嘌呤[4-5]。GD在細胞成熟過程中發揮重要作用[6]。蛋白質組的結果顯示MSCs表達的GD比FBs表達多，證實了MSCs是未成熟細胞，仍含有較多的促進細胞成熟的酶功能活躍，催化細胞的成熟。

Annexin A5是與細胞衰老過程密切相關的蛋白，在細胞凋亡的過程中，Annexin A5相互結合[7]。蛋白質組的結果顯示MSCs表達的Annexin A5比FBs少，提示MSCs是比FBs更年輕的細胞。SOD-2是一種抗氧化劑，可以提高多種酶mRNA的水平，SOD-2水平的提高可以防止細胞的損傷[8]。蛋白質組的結果顯示MSCs表達的SOD-2水平高于FBs，提示MSCs處于較幼稚的階段，機體對其產生了良好的保護機制[9]。

綜上所述，MSCs和FBs蛋白表達譜相似，故具有相似的生物學功能，均可作為組織工程種子細胞。但兩者蛋白表達仍存在不同，導致了兩者功能的差別。本研究第一次從蛋白水平闡述了MSCs和FBs不同功能與蛋白表達差異的關系，找到了4種有意義的差異蛋白質，可以更深入的理解MSCs具備高分化潛能而FBs不具備的原因，為選擇更適合的組織工程種子細胞提供了更多的理論依據，并由此推斷MSCs作為組織工程種子細胞具有更廣泛應用的前景。

[參考文獻]

[1]邱 俊， 周繼紅，張 波， 等. 胎兔皮膚無瘢痕愈合相關蛋白的篩選與初步分析[J].中國美容醫學， 2007， 16(1):11-14.

[2]Lawson D， Harrison M， Shapland C. Fibroblast transgelin and smooth muscle SM22alpha are the same protein， the expression of which is down-regulated in many cell lines[J]. Cell Motil Cytoskeleton， 1997，38(3):250-257.

[3]Thweatt R， Lumpkin CK Jr， Goldstein S. A novel gene encoding a smooth muscle protein is overexpressed in senescent human fibroblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1992，187(1):1-7.

[4]Chang YJ， Huang CH， Hu CY， et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of Bacillus subtilis guanine deaminase[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2004，60(Pt 6):1152-1154.

[5]Giese RD， Snyder FF. cDNA sequence of five mouse guanine deaminase (Gda) alleles and mapping to mouse chromosome 19[J]. Genome， 2002，45(2):276-281.

[6]Brosh S， Sperling O， Bromberg Y， et al. Developmental changes in the activity of enzymes of purine metabolism in rat neuronal cells in culture and in whole brain[J]. J Neurochem， 1990，54(5):1776-1781.

[7]Ohshima S. Apoptosis and necrosis in senescent human fibroblasts[J]. Ann N Y Acad Sci， 2006，1067:228-234.

[8]Sinha S. Anti-oxidant gene expression imbalance， aging and Down syndrome[J]. Life Sci， 2005，76(12):1407-1426.

[9]Leccia MT， Yaar M， Allen N， et al. Solar simulated irradiation modulates gene expression and activity of antioxidant enzymes in cultured human dermal fibroblasts[J]. Exp Dermatol， 2001，10(4):272-279.

[收稿日期]2008-02-21[修回日期]2008-05-13

編輯/張惠娟