ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ實時熒光定量ＰＣＲ檢測ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ方法的建立

[摘要]目的：建立SYBR green 實時熒光定量PCR 檢測VEGF mRNA 水平的方法，并初步應用于美容相關疾患。方法：構建內參GAPDH 質粒，倍比稀釋VEGF 和GAPDH 標準品，建立PCR 標準曲線，同時繪制熔解曲線，后應用SYBR Green 實時熒光定量PCR 檢測正常皮膚、燒傷瘢痕、惡性黑素瘤細胞株A2058和WM793 cDNA的VEGF mRNA 水平。結果：VEGF、GAPDH的標準曲線，符合線性要求，相關系數r均為1，熔解曲線峰值單一，產物特異度好，四組樣本的SYBR green 熒光定量PCR結果提示瘢痕組織、A2058、WM793 的VEGF mRNA 水平明顯高于正常皮膚。結論：本研究成功建立了VEGF mRNA 水平的SYBR green 熒光定量PCR 檢測方法。

[關鍵詞]血管內皮生長因子；瘢痕疙瘩；血管瘤；惡性黑色素瘤；SYBR green實時熒光定量PCR

[中圖分類號]R826.8[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）06-1025-03

Establishment of VEGF mRNA detection by using SYBR green

real-time fluorescent quantitative PCR

LUAN Qi，SUN Jing，SUN Lin-chao，LI Chun-ying，GAO Tian-wen

(Institute of Dermatology of Chinese PLA， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi， China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of SYBR green real-time quantitative PCR for detecting mRNA levels of VEGF， and apply the method to cosmetic diseases preliminarily.MethodsThe recombinant plasmid of GAPDH was constructed as standard control. Standard curves of VEGF and GAPDH were established by using a series dilution of quantified plasmids and the specificity of PCR products was analysed by their melting curves. VEGF mRNA levels of normal skin， burning scar， A2058 and WM793 melanoma cell lines were measured by SYBR green real-time quantitative PCR.ResultsTwo standard curves of VEGF and GAPDH had a linear feature and their R values were both 1. In addition， the melting curve analysis showed a single peak. The results of four groups showed that the VEGF mRNA levels were higher in burning scar tissue， A2058 cells and WM793 cells than that in normal skin tissue.ConclusionThe method of detecting VEGF mRNA levels by SYBR green real-time quantitative PCR was established successfully in this study.

Key words: vascular endothelial growth factor(VEGF); keloid; hemangioma; m alignant melanoma; SYBR green real-time quantitative PCR

血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一類功能多樣的生長因子，主要參與新生血管和淋巴管的形成。越來越多的研究提示，VEGF不僅與諸多美容疾患的發病密切相關，而且VEGF 的表達量亦常作為判斷病程預后以及選擇治療策略的重要因素之一，這些疾患主要包括血管瘤[1]、瘢痕疙瘩[2]、惡性黑色素瘤[3]等美容范疇相關疾病。因此，本研究旨在運用新型的mRNA 定量技術平臺--SYBR green 實時熒光定量PCR，建立VEGF mRNA 的檢測方法，并初步應用于以上相關疾病的研究中。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和組織來源：惡性黑素瘤細胞株A2058 和WM793 由本研究所購自美國ATCC公司；燒傷瘢痕組織由西京醫院燒傷外科提供。

1.1.2 試劑和主要儀器：DMEM 購自美國Gibco 公司，T4 連接酶和SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒購自Takara 公司，Trizol 和SuperScriptTM Ⅲ 反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司，PTC2200 熒光定量PCR 循環儀由美國MJ 公司提供。

1.1.3 載體和引物設計：pGEM-T 載體為Promega 公司產品，pIRES2-EGFP-VEGF 由西京醫院超聲科于銘博士惠贈；依據VEGF mRNA 序列，選取包含VEGF 所有亞型的引物序列如下[4]：上游為5'-GCACCCATGGCAGAAGG-3'，下游為5'-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3'，產物大小105bp；內參GAPDH 引物序列為[5]：上游為5'- AGGGGTCTACATGGCAACTG -3'，下游引物為5'- CGACCACTTTGTCAAGCTCA -3'，產物大小227bp；以上引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣本總RNA的提取：Trizol 法分別提取正常皮膚、燒傷瘢痕、A2058、WM793的總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA 質量和濃度；取RNA 3μg行逆轉錄反應，步驟按說明書進行，所得cDNA 置-20℃ 保存。

1.2.2 標準品質粒的構建和定量：取各組cDNA 模板2μl，用內參GAPDH 上、下游引物行PCR 反應， 條件為94℃ 3min， 94℃30s、57℃30s、72℃30s、35個循環，72℃5min；將回收PCR 產物與pGEM-T 載體4℃ 連接過夜，將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選陽性克隆，擴增后抽提質粒，命名為pGEM-GAPDH，行PCR 鑒定正確后作為內參GAPDH的標準品質粒。VEGF 的標準品質粒為pIRES2-EGFP-VEGF。

1.2.3 標準曲線的繪制：根據標準品質粒pGEM-GAPDH、pIRES2-EGFP-VEGF定量結果和片斷大小，查閱《分子克隆（第三版）》第1664頁，得出質粒的拷貝濃度，后將其稀釋為以下五個拷貝濃度（單位：拷貝/μl），分別為pGEM-GAPDH：10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴ 拷貝/μl，pIRES2-EGFP-VEGF為10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³ 拷貝/μl，作為mRNA 定量的標準品，以此繪制標準曲線。

1.2.4 SYBR green 實時熒光定量PCR 檢測VEGF mRNA 水平：實驗分四組，分別為正常皮膚組、燒傷瘢痕組、A2058組和WM793組；反應體系為cDNA 模板1μl，上下游引物1μl，2×SYBR Premix EX Taq 10μl，水補至20μl；反應參數為95 ℃10s，57℃15s，72℃15s，熒光檢測1次，共45個循環，從70 ℃至95℃，每0.4℃/s 為間隔繪制熔解曲線，反應結束后根據熔解曲線分析產物特異性。每組設3個復孔，即n＝3。

1.2.5 統計學分析：數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析，形式均采用x±s表示，數據處理應用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示有統計學差異。

2結果

2.1 GAPDH 和VEGF 的標準曲線：根據GAPDH 和VEGF 質粒DNA 定量結果，將其倍比稀釋，行PCR后可見所得擴增曲線為典型的倒S形曲線，從左至右質粒DNA 濃度依次以10倍遞減，且模板濃度越高，其循環閾值即Ct 越小，且五個樣本基本處于一條直線，GAPDH 的相關系數r 為1，斜率為 -0.2869（圖1-A），VEGF 的r 值為1，斜率為 -0.3064（圖1-B），說明熒光定量PCR的質量控制較好，符合下步定量實驗要求。

2.2 PCR產物特異度分析：各組樣本的VEGF熒光定量PCR 前，觀察熔解曲線，以熔解曲線峰值的一致性，檢測產物的特異度，也是結果是否準確可信的重要參考指標。從GAPDH 和VEGF 的熔解曲線圖可以看出，各樣本的峰值基本一致（圖2），左峰為VEGF，右峰為GAPDH，二者均未見雜峰信號出現，說明二者的PCR 參數選擇適當，產物特異度較好，非特異產物對結果影響較小，為下步定量打下基礎。

2.3 各組樣本VEGF 的mRNA 水平檢測結果：將各組cDNA 樣本行VEGF 的熒光定量PCR，反應結束后，根據軟件Opticon Monitor 3.0 所產生的各反應孔目的基因拷貝數，將各組結果整理分析后，如表1，結果顯示VEGF的表達水平在10³的數量級，GAPDH在10⁷數量級，二者比值即為VEGF mRNA 在各組樣本中的相對表達水平。

將各組VEGF 的mRNA 水平經過GAPDH 標準化后進行比較，結果提示（圖3），燒傷瘢痕、惡性黑素瘤細胞株A2058、WM793 的VEGF mRNA 水平均高于正常皮膚，燒傷瘢痕可高達2.4倍，A2058、WM293 分別可高達13.6倍和5.3倍，以上結果與以往研究一致，而腫瘤細胞系的VEGF mRNA 則明顯高于燒傷瘢痕組織。

* P＜0.05 vs 正常皮膚組

圖3 VEGF mRNA 的SYBR 熒光定量PCR 結果

3討論

VEGF 是血小板源性生長因子家族成員，可由多種細胞分泌，如內皮細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞等。VEGF 與其受體結合后可產生多種生物學效應：提高血管通透性，促進內皮細胞增殖和血管生成，改變細胞外基質，參與免疫系統調節等。VEGF 的諸多生物學功能決定了該因子重要的生理、病理作用，本研究所討論的是VEGF 在美容相關疾患中所扮演的角色。首先，血管瘤作為嬰幼兒期最常見的腫瘤之一，其發生、發展與VEGF 的關系密切，有學者發現VEGF 和雌激素可協同促進血管瘤內皮細胞的增殖[1]。瘢痕疙瘩具有侵襲性生長和術后易復發的特點，一直是困擾美容學界的難題，研究表明，瘢痕疙瘩的產生是由分泌的VEGF 促內皮細胞增殖、遷移所誘發，有研究就發現外源性VEGF 可通過生長因子受體促進瘢痕成纖維細胞的增殖[2]。而在惡性黑素瘤，VEGF既能促進內皮細胞的增殖，又能促進血管滲漏，在惡性腫瘤的生長、轉移中有著重要作用。當然，VEGF 相關的美容疾患絕不僅僅以上幾種，它豐富的生物學效應決定了VEGF 在多種美容疾病的重要作用，因此，建立一種準確、簡便的VEGF 表達水平檢測方法就顯得尤為重要。

本研究所采用的新型mRNA 檢測手段--SYBR green 實時熒光定量PCR技術，屬于近年來新興的在基因水平上檢測目的基因表達的理想方法，正越來越多的應用到各項研究中[6]。實時熒光定量PCR 不僅可用于檢測低豐度mRNA，而且還可以借助標準品質粒達到定量的目的。該方法與常規RT-PCR 方法相比，其優點主要在于：在PCR 反應的對數期檢測其Ct 值，優于積累PCR 產物量進行終點檢測，使定量更準確、重復性更好；無需PCR 后處理，反應全程閉管操作大大降低了交叉污染的危險性。而在目前的熒光定量PCR 中，較為簡單、經濟、有效的方法便是通過嵌入雙鏈DNA 的熒光染料--SYBR Green 來檢測PCR 擴增產物。在PCR 的延伸階段，SYBR Green 與雙鏈DNA 相結合而發出熒光，隨著反應的進行，熒光信號逐漸增強。熒光信號的強度依賴于反應體系中現有的雙鏈DNA （包括特異性擴增產物和引物二聚體等）的量。因此，一旦PCR 反應體系中出現非特異擴增，就會影響到定量結果的可靠性與重復性。本研究中，我們通過熔解曲線控制反應的特異度，通過標準品質粒的拷貝數來繪制標準曲線，提高檢測的重復性。從本研究所得到熔解曲線及標準曲線看，SYBR 熒光定量PCR 的質量控制較好，結果較為準確可靠。

本研究以絕對定量的GAPDH 和VEGF 標準品質粒為參照，對正常皮膚、燒傷瘢痕組織、惡性黑素瘤細胞株A2058、WM793 的VEGF mRNA 的表達水平進行了SYBR green 熒光定量PCR 檢測，建立了一種切實可行、客觀可信的VEGF mRNA 表達水平的檢測方法。

[參考文獻]

[1]Xiao X， Liu J， Sheng M. Synergistic effect of estrogen and VEGF on the proliferation of hemangioma vascular endothelial cells[J]. J Pediatr Surg， 2004， 39(7):1107-1110.

[2]Wu WS， Wang FS， Yang KD， et al. Dexamethasone induction of keloid regression through effective suppression of VEGF expression and keloid fibroblast proliferation[J]. J Invest Dermatol， 2006， 126(6):1264-1271.

[3]Rivera RS， Nagatsuka H， Siar CH， et al. Heparanase and vascular endothelial growth factor expression in the progression of oral mucosal melanoma[J]. Oncol Rep， 2008， 19(3):657-661.

[4]Takenaka K， Katakura H， Chen F， et al. The ratio of membrane-bound form Flt-1 mRNA to VEGF mRNA correlates with tumor angiogenesis and prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Lett， 2007， 246(1-2):34-40.

[5]Kato M， McDonald KJ， Khan S， et al. Expression of human DEC-205 (CD205) multilectin receptor on leukocytes[J]. Int Immunol， 2006， 18(6):857-869.

[6]Draganov P， Todorov S， Todorov I， et al. Identification of HPV DNA in patients with juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis using SYBR Green real-time PCR[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol， 2006， 70(3):469-473.

[收稿日期]2008-03-29 [修回日期]2008-05-16

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”