建立嵌合體誘導移植免疫耐受的研究進展

復合組織異體移植（Composite Tissue allotransplantation，CTA）為修復重建外科提供了新的治療途徑。燒傷、創傷及面部腫瘤手術切除等造成顏面組織器官缺損畸形，損傷的部位常包括耳、鼻、眼瞼和口唇等體表器官，其修復比較困難[1]。對于嚴重毀容患者，通過植皮或皮瓣移植等現有的方法難以使患者的容貌恢復正常，應用異體復合組織移植進行顏面重建修復效果明顯優于自體組織移植，但宿主對異體復合組織尤其是皮膚組織的強烈排斥反應使其仍無法推廣應用，采用足夠的免疫抑制劑可以減少急性排斥反應。然而，慢性排斥、免疫抑制劑的毒副作用、長期服用免疫抑制劑而導致的機會性感染和惡性腫瘤的風險增加等問題仍未得到解決[2]。對復合組織移植物的免疫耐受誘導可能是解決這些問題的最好途徑之一。嵌合是指受體在接受異體或異種移植物后，其體內存在著供體細胞，而在移植物內存在著受體細胞，這種供受體細胞相互移行、相互存在的現象稱為嵌合現象（Chimerism）。造血干細胞嵌合體是指異基因造血干細胞移植后供者和受者血細胞共存于受者體內的現象。形成造血干細胞嵌合體可以有效地誘導和維持受體對移植器官的免疫低反應，而骨髓移植（Bone Marrow Transplantation，BMT）是建立穩定的混合嵌合體進而誘導受體對各種移植器官的供體特異性免疫耐受的有效途徑。最近，以造血嵌合體誘導移植免疫耐受的實驗和臨床研究已經取得了初步的成果，其治療方案有望在臨床上廣泛應用。

1建立造血嵌合體是誘導免疫耐受的重要途徑

嵌合體（Chimerism）是一種誘導和維持受體對器官移植物的免疫低反應性的有效方法。目前來看，通過造血嵌合體誘導免疫耐受是最有可能在臨床上廣泛應用的免疫耐受誘導方案。誘導免疫耐受的機制與對自身抗原維持耐受的機制基本一致，消除、無能、調節/抑制和忽略。中樞性T細胞耐受是通過胸腺內T細胞遞呈抗原缺失介導的。它也可通過供體抗原胸腺內直接注射誘導。然而，因沒有持續的供體抗原通過這一途徑供應，中樞性耐受只能維持比較短的時間。相反，在嵌合體中，應用造血干細胞移植（HSCT，hematopoietic stem cell transplantation）誘導免疫耐受時，造血干細胞來源的供體抗原可持續的呈遞給胸腺，使新產生的供體反應性胸腺細胞對供體抗原具有長期的陰性選擇。一般認為，這是T細胞耐受的最穩定形式，因為這是系統性地消除對供體抗原存在反應活性的T細胞克隆。

嵌合體可分為全嵌合體，宏嵌和體以及微嵌合體三種形式，三者的誘導方法、嵌合體細胞的性質、其在受體外周血中所占比重及其發揮作用的方式存在差別。

全嵌合體（full chimerism）：嵌合體誘導免疫耐受最早見于接受常規骨髓移植的患者，可隨后接受同一供體來源的器官移植，而不需用長期免疫抑制劑治療[3]。然而，誘導這種全供體嵌合體需要對受體進行包括全身照射等高強度的骨髓移植前預處理（conditioning），而這些預處理通常會明顯損害受體免疫力。

宏嵌和體（macrochimerism）：宏嵌和體是外周血中存在持續性高水平的供體造血干細胞，其預處理方案副作用相對全嵌合體較小，它是基于誘導“混合嵌和體”（mixed chimerism）的概念，也稱為受體和供體造血細胞的共存。混合嵌合體相對于全嵌合體而言，在其誘導過程中，可降低預處理方案的強度，對宿主的免疫力進行適當保護，從而有效降低移植物抗宿主疾病的發生率[4]。

微嵌合體（microchimerism）：微嵌合體即低比例的供體來源的造血細胞（＜1%） 持續存在于受體中。微嵌合體經常見于實質器官移植后由于移植物內供體“過客白細胞”（passenger leukocytes）的遷移產生。微嵌合體現象最早在僅需要少量的免疫抑制劑治療，就可以控制移植排斥反應，維持移植器官良好功能的受體外周血中可檢測到。微嵌合體現象在移植耐受中發揮著一定作用[5]。

宏嵌合體與誘導所謂的“中樞耐受”有關，因為它可使胸腺內新產生的所有供體反應性T細胞發生克隆刪除（clonal deletion）。而在混合嵌合體中，在胸腺內供體和受體來源的抗原提呈細胞的共存，將導致供體反應性和受體反應性兩種T細胞的克隆刪除，從而達到相互耐受?；旌锨逗象w可作為一種誘導免疫耐受的途徑，但建立穩定的混合嵌合體，從而誘導和維持免疫耐受的最佳方案仍未確定，因此無法展開廣泛的臨床應用。

2穩定的耐受所需要的嵌合體細胞的數量和性質

嵌合體外周血中，造血干細胞的數量和性質是誘導耐受的決定性因素[6]。宏嵌合體與供體特異性移植耐受具有因果關系，而微嵌合體被認為是一種器官移植后繼發產生的副現象[7]。然而，在宏嵌合體中，嵌合體細胞的數量并不總是與免疫耐受成正相關[8]。在微嵌合體中少量嵌合供體細胞通過作為“否決細胞”或“調節細胞”積極地預防破壞性同種異體免疫反應[9-10]。既往的研究表明不僅器官移植后的“過客白細胞”（passenger leukocytes），而且在可以通過胎兒－母體模式交換造血干細胞的動物模型中，也會產生與抑制T細胞反應有關的持續存在的微嵌合體[11]。在巨嵌合體，并不是所有供體造血干細胞來源的細胞成分均等地參與供體特異性免疫耐受的誘導過程。但究竟是哪種細胞在發揮著最主要的作用，目前仍沒有明確。在一些模型中顯示，供體T細胞在外周血的產生是至關重要的。大部分的模型盡管都有高水平的嵌合體存在，但沒有供體T細胞的嵌合體仍可排斥供體皮膚移植物，并在體外實驗中顯示出強有力的抗供體抗原的反應[12]。

此外，還有學者認為，一定的嵌合供體細胞數量對保護移植物是相當必要的。在嵌合體中誘導免疫耐受所需要的供體細胞數量問題上，移植物的免疫原性可能發揮了決定性作用。因為與低免疫原性心臟移植比較，高免疫原性小腸或復合組織移植物需要高比例的供體嵌合體。

3混合嵌合體誘導免疫耐受的機制：T細胞刪除

刪除同種反應性細胞是免疫耐受誘導的機制之一，沒有同種反應細胞，就無法介導排斥反應。刪除可以通過非特異性手段，即通過刪除某些免疫器官（如胸腺）的特異功能進行。胸腺性或中樞性刪除機制是目前的移植免疫耐受研究的重點。中樞耐受是由于胸腺中存在供體來源的抗原提呈細胞，而引起供體反應性T細胞的克隆刪除，它被認為是誘導供體特異性耐受的最安全方法[13]，這一機制可見于絕大多數的混合嵌合體模型中。

混合嵌合體誘導免疫耐受還存在外周機制。外周機制如誘導無能、主動抑制、否決細胞活動或T細胞的外周性刪除現象也見于混合嵌合體誘導和維持的免疫耐受中[14-15]。不僅嵌合造血供體細胞積極參與這些外周機制的誘導，移植器官本身可能也參與了免疫耐受的誘導。有學者發現，移植器官的存在可能也有助于移植耐受的維持和延續[16]，特別是當免疫抑制治療中存在共刺激途徑阻斷劑時[17]。而這一移植器官產生的作用，正好可以解釋早期存在外周嵌合體，而后外周血嵌合現象喪失的受體其免疫耐受狀態仍可持續維持的原因，雖然在這種受體內，不能排除一定程度上的與克隆刪除有關的胸腺嵌合體持續存在的可能。

綜上所述，可以認為混合嵌合體與中樞和外周耐受都有一定相關性。由于同時存在中樞和外周兩種免疫耐受誘導機制，使混合嵌合體成為誘導移植耐受的有力工具，因為它導致了同種異體反應性供體和受體T細胞、B細胞和NK細胞的相互耐受[18]，但它也可能有甚至更廣泛的用途。在以混合嵌合體誘導同種異體胰島細胞移植免疫耐受的NOD大鼠中，受體不僅清除了同種異體反應性T細胞，而且糖尿病基因宿主T細胞也產生了克隆刪除，從而導致自身免疫的逆轉[19]。

4建立混合嵌合體誘導免疫耐受的低毒途徑

造血干細胞移植（HSCT）按其來源可分為骨髓移植、外周血干細胞移植和臍血移植；按供者骨髓來源可分為同基因、同種異基因和自體造血干細胞移植三類。根據預處理方案的強度不同可分為清髓性造血干細胞移植及非清髓性造血干細胞移植。

清髓性造血干細胞移植：在血液疾病的治療中，傳統的異基因造血干細胞移植主要采用大劑量全身照射（TBI）和化療做清髓性預處理，以克服宿主抗移植物（HVG）和移植物抗宿主（GVH）兩種免疫反應，使供者細胞植入，完全替代異常的宿主細胞并產生移植物抗白血病效應（GVL）。此種異基因HSCT供者細胞植入穩定可靠，抗白血病（腫瘤）作用強，白血病復發率低，治療效果好。但其主要缺點是危險性大（造血抑制引起的出血和感染可致死），并發癥多（如移植物抗宿主?。℅VHD）、間質性肺炎等?？芍滤溃?，生存質量差（肝、肺、腎、心等重要臟器及生殖、免疫系統功能損傷重等）。如何從根本上減輕移植相關并發癥，進而改善HSCT的療效是值得研究的問題。

非清髓性造血干細胞移植：傳統的清髓性干細胞移植預處理方案，是為了最大限度地殺滅受體腫瘤細胞，以便造血干細胞植入及減少白血病復發。但不可避免地伴有毒副反應的發生，甚至可能是致死性的。近年來許多學者傾向于減低預處理的劑量，減少清髓性預處理的并發癥，從而使HSCT的適用范圍更廣泛。1997年，Giralt等[20]首先提出并開展了非清髓性造血干細胞移植（NST）的臨床研究。非清髓性造血干細胞移植是指通過較小劑量的化療、放療（或不用放療），使供受體間產生雙向免疫耐受，以利于供者造血干細胞植入，形成嵌合體再利用植入的異基因免疫活性細胞誘導產生免疫效應。

非清髓預處理與傳統的清髓性干細胞移植的預處理方案本質上無區別，均以形成異體植入為目標，只是將預處理強度適度降低。以減輕放化療劑量，而增加免疫抑制劑的使用，既減低放化療的毒性，減少骨髓抑制的時間，又使供者干細胞可以植入。NST的特點是預處理劑量低，毒副反應小，植入速度快，多數能形成混合嵌合體。

全嵌合體和混合嵌合體均可以誘導供體特異性免疫耐受，但只有混合嵌合體可以在毒副作用較小的預處理條件下獲得，更好地保護患者的免疫力。因此，誘導混合嵌合體的方案具有顯而易見的應用優勢，并得到了更為廣泛深入的研究。

5抗原非特異性共刺激途徑的阻斷在誘導免疫耐受中的意義

抗原非特異性共刺激（Co-stimulation）途徑的阻斷在建立混合嵌合體誘導免疫耐受中具有重要意義。CD4+T細胞激活需要2個刺激信號，其一為由APC表面抗原肽－MHCⅡ類分子與CD4+T細胞表面TCR-CD3復合物結合產生的第一信號，此即特異性抗原識別信號；其二即共刺激信號（co-stimulation signal），也稱第二信號，乃由APC表面粘附分子與CD4+T細胞表面相應配體結合所提供。共刺激信號為抗原非特異性，但為CD4+T細胞特異激活所必需，它決定接受抗原刺激的CD4+T細胞是發生增殖，還是轉變為無能（anergy）狀態（或死亡）。CD152又稱細胞毒性T細胞抗原4（CTLA4），為同源二聚體，主要表達于活化T細胞，靜止T細胞則不表達。CD152的配體是B7-1和B7-2，但二者結合能抑制活化T細胞增殖，對T細胞應答起負調節作用，故CD152屬抑制性受體。通過干擾同種異體移植抗原特異性T細胞或APC表面某些粘附分子或其配體的表達，或應用粘附分子抗體、可溶性配體封閉相應粘附分子，有可能阻斷受者體內同種抗原特異性T細胞的共刺激信號，通過誘導相應T細胞失能而建立移植耐受。在諸多共刺激分子中，B7-CD28和CD40/CD40L分子對是參與T細胞活化最重要的共刺激通路，所以最常用阻斷劑抗CD154抗體（阻斷CD40/CD40L途徑）和CTLA4-Ig（阻斷CD28-B7途徑）來誘導免疫耐受[21]。

CD154（CD40L）和其受體CD40在抗原提呈和免疫調節中起重要作用[22]。CD40是TNF受體超家族成員，分子量50 kDa，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達在專職APCs（DC和肥大細胞）和內皮細胞，與CD154結合。CD154是TNF超家族成員，分子量32kDa～39kDa，表達在T細胞（CD4+T和CD8+T）、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞、樹突狀細胞、血小板和自然殺傷細胞上。CD40與其配體結合后誘導激活磷脂酰肌醇第二信號系統，激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和分裂素活性蛋白激酶，然后激活轉錄因子如NF-κB和c-Jun，因此增加了APC的功能。CD40的結合可促進B7和MHC分子的表達，因此增加了信號1和信號2作用。阻斷該通路可以阻止抗原的有效提呈并能導致T細胞無能。但是一旦該通路阻滯劑去除后，免疫活性可以恢復，這種免疫無能狀態難以維繼。但是不管怎樣，在大動物模型中封閉CD154可使藥物撤除后移植物存活數月到數年[23]。毫無疑問共刺激通路在啟動同種免疫反應中起關鍵作用。

而值得注意的是，Wekerle 發現只有進行共刺激阻斷的情況下，才可以通過高劑量BMT獲得持續性的混合嵌合體[24]。Blaha也認為共刺激阻斷是目前以非清髓性預處理骨髓移植誘導供體特異性免疫耐受的最為有效的方法[25]。在供體特異性骨髓移植中，阻斷共刺激途徑可以提高嵌合率并促進器官移植物如心臟的免疫耐受誘導[26]。利用抗CD154 和CTLA4-Ig 阻斷共刺激途徑CD40-CD40L 和CD28-B7 ，聯合骨髓移植，可導致供體特異性CD8+ T 細胞快速耐受和誘導造血細胞性嵌合體產生及供體特異性耐受，即使在主要組織相容性復合物（MHC）完全不匹配的大鼠中[27]。如果CD8+ T 細胞被刪除，單獨應用抗CD154 可獲得相似的結果。最近資料表明，如果給予供體特異性輸注，全CD8+ T 細胞刪除是不必要的。接受3Gy 全身照射的大鼠，若給予供體特異性輸注、骨髓移植和抗CD154可產生持續性的混合嵌合體和耐受。CD4+ 和CD8+ T細胞對供體抗原均產生耐受，但對其他抗原仍有反應[28]。如果供體特異性輸注與抗CD154一起給予，不需照射即可誘導穩定的同種異基因的嵌合體和耐受[29]。

近年來，利用基因工程的重組載體和基因轉移技術，將人CTLA4-Ig基因克隆至腺病毒穿梭質粒pCA13中去，然后再把該質粒同腺病毒輔助質粒pJM17體外同源重組，用HEK293細胞包裝CTLA4-Ig腺病毒，最后經過空斑純化和鑒定，篩選出表達CTLA4-Ig的腺病毒載體，大量制備CTLA4-Ig的腺病毒，用于體內誘導耐受實驗。Reddy等[30]以腺病毒為載體將CTLA4-Ig的cDNA轉染移植到小鼠肝細胞，可將排斥期推遲50天以上。Chen等[31]應用腺相關病毒載體把CTLA4-Ig導入心肌細胞，而后移植入異體體內，顯著的延長心臟的存活時間。Guillot等[32]也進行了相似的實驗，用腺病毒介導CTLA4-Ig轉染移植的心肌，發現可以顯著的延長移植物的存活時間，90%的移植物存活時間大于100天，且移植1年后還能在血漿中檢測出CTLA4-Ig;而用CTLA4-Ig蛋白全身注射處理組，僅能延長移植物存活期22天左右，代謝也較快，顯示了基因治療的良好效果。張慶殷等[33]在鼠異體心臟移植術中注射供體脾細胞和CTLA4-Ig腺病毒，然后再輸注供體骨髓細胞，發現能夠提高嵌合體水平，延長異基因大鼠心臟移植物存活。其實驗原理在于構建含CTLA4-Ig基因的腺病毒載體后，通過腺病毒介導的CTLA4-Ig基因治療，在受體內不斷分泌高活性的CTLA4-Ig蛋白，封閉共刺激信號，誘導外周耐受，然后給予骨髓細胞以建立混合嵌合體，誘導中樞耐受。

6器官移植免疫耐受范疇的發展

一般認為，免疫耐受是指在沒有免疫抑制藥物治療的情況下移植物仍然能夠長期存活。真正意義上的完全性免疫耐受（Complete Tolerance）包括：①沒有抗供體的同種抗體；②在同種移植物活檢中沒有破壞性淋巴細胞浸潤的跡象；③能檢測到移植物的抗供體特異無反應性相關指標。

隨著器官移植領域的不斷發展和移植免疫學研究的不斷深入，免疫耐受的范疇也隨著治療方案的發展而發生改變。完全性免疫耐受（Complete Tolerance）是指在無需免疫抑制劑維持治療的情況下移植物可以長期存活并保持穩定功能的狀態。然而，Monaco認為在誘導免疫耐受時，更為現實的目標是能否使用最低限度的免疫抑制劑治療即可以維持移植物的長期存活[34]。Calne則提出了“'Prope' （almost） Tolerance”，即“支持性的”或“近似完全”的免疫耐受概念，即僅需要低劑量的CsA即可維持或延長移植物的存活期并避免急性或慢性排斥反應，從而降低免疫抑制劑的副作用[35]。Demir也認為，“部分免疫耐受”（Partial Tolerance）的概念更適合于臨床治療[36]。Sachs[37]對免疫耐受的概念進行了更新，認為免疫耐受不僅是反應的消失，而且還應該包括免疫活化反應的下調，而這種下調可以由多種機制誘導。

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[收稿日期]2008-06-07 [修回日期]2008-08-05

編輯/李陽利