毛囊干細胞及其分離與識別方法的研究進展

干細胞是指未成熟細胞，具有自我更新和分化能力，可分化為胚胎干細胞和成體干細胞、其他細胞、組織及器官[1] ，胚胎干細胞是最有應用價值的干細胞，但由于來源于胚胎，進行相關研究和治療必然涉及倫理和道德問題，所以胚胎干細胞的研究受到限制，而來源于同體的成體干細胞就不存在這種限制。皮膚組織更新速度快、再生能力強，因此，來自皮膚局部的干細胞受到了重視。研究表明，毛囊干細胞( hair follicle stem cells ，FSC)能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，是皮膚組織工程理想的種子細胞，已成為目前的研究熱點?，F就毛囊干細胞及其分離與識別方法的研究進展綜述如下。

1毛囊的解剖特點

毛囊是表皮向真皮中凹陷后形成的特殊結構，位于毛發下段。毛囊內外由上皮性毛根鞘和毛囊周圍鞘兩部分組成， 兩者之間有玻璃膜。它包圍著毛根，上面附有立毛肌，亦與皮脂腺相連，其最外層被毛囊周圍鞘圍繞。上皮性毛根鞘起源于表皮， 又分內根鞘和外根鞘。外根鞘相當于表皮的基底層和棘細胞層。毛囊可分為上下兩部， 上部也稱為恒定部即毛囊的上段，可再分為漏斗部和峽部，在峽部末端外毛根鞘細胞增殖，并且形成隆突區(bulge)， 成為毛發上段的標記。該隆突部位可環繞整個峽部末端或僅限于單側即立毛肌附著處， 目前被認為是毛囊干細胞存在的主要部位。在毛囊的周期性生長過程中，這部分保持穩定，不發生凋亡和再生。下部也稱為循環部，可再分為球部和莖部，包括隆突部以下的毛囊和毛球。在毛囊的周期性生長過程中，這部分呈現出生長、衰退、靜息和脫落的形態變化。根據循環部的變化，毛發再生過程中[2]，毛囊依次經歷生長期、退化期、靜止期及脫落期，完成一個生長周期，毛囊周期生長是由毛囊干細胞和間質細胞的共同作用完成的。

2毛囊干細胞的定位

目前普遍認為毛囊干細胞定位于毛囊上段的隆突區。1990 年，Cotsarelis 等[3]采用連續[3H]-T 標記發現小鼠皮膚、睫毛、觸須的毛囊球部并未見標記細胞及干細胞指征，但在隆突區可見，相反應用脈沖[3H]-T標記則發現標記物布滿毛母質，而隆突區未見，于是提出“隆突激活假說”(bulge activation hypothesis) 。此后，Taylor 等[4]采用BrdU 和[3H]-T 雙標記方法亦證實毛囊干細胞定位于上段的隆突區。在體外培養實驗中，將生長期小鼠毛囊橫切成四部分進行分段培養，發現95%的克隆形成細胞來自于含有隆突區的片段，其余少數克隆來自于毛球部[5]；培養人毛囊細胞，亦發現克隆形成細胞主要出現在外根鞘中段，近似于立毛肌附著點[6]。盡管越來越多的人贊同決定毛囊下段周期性生長的干細胞定位于隆突區，然而利用干細胞慢周期特性和毛囊生長周期特點對人毛囊進行體外分析，結果發現人毛囊干細胞在胚胎期定位于隆突區，而在成人則定位于毛囊下段-隆突區以下的外根鞘中[7]。應用毛囊干細胞特征標記物角蛋白19(keratin 19，K19) 進行檢測亦可見陽性細胞出現在隆突區和毛囊下段兩個區域[8]，這意味著毛囊中可能有兩個干細胞儲存庫，或者是在個體發育過程中早期細胞發生了下移的結果。此外，不同物種或同一物種的不同部位毛囊干細胞的定位都有所不同，如在手足部位，這些干細胞存在于表皮網狀嵴的深層，而在頭皮部位則定位淺表或位于表皮嵴的頂部及立毛肌附著的毛囊隆突區[9]。因此人類毛囊干細胞的確切定位尚有爭論，這妨礙了人們理解毛囊干細胞在上皮生物學、創傷愈合以及腫瘤發生中的作用。

3毛囊干細胞的分離及純化

許多研究者采用不同的方法試圖將毛囊干細胞分離出來，以進行更深入的研究，目前對毛囊干細胞分離及純化有以下幾種方法：

3.1熒光標記細胞激活技術也稱為流式細胞儀分選：這種方法可將帶有一種或幾種熒光標記的細胞分選出來，原理科學，操作方便，被眾多研究者采用。2004年，Fuchs等[10]利用該技術從毛囊隆突部純化出了毛囊干細胞，這種方法的優點是準確，但標記細胞體外培養活力不好，不容易傳代培養。

3.2應用酶消化法[11]：將皮膚樣本剪成小條，分離酶（dispase）低溫消化后鏡下切取毛囊隆突部，置于胰酶中37℃消化后1000r/min離心收集細胞加無血清的DMEM條件培養液培養，每3天換液。消化法分離的毛囊干細胞純度較高，細胞分布均勻，細胞克隆形成能力強，增殖迅速被普遍應用于毛囊干細胞的初步分離，但獲得的干細胞經歷倍增期后，生長速度減慢，進入平臺期，其原因可能是酶消化破壞了干細胞與微環境的聯系；有研究表明[12]，在應用分離酶消化的過程中37℃消化2h，較以往4℃消化12h縮短了消化時間，能避免干細胞損傷。

3.3組織塊法分離毛囊隆突部干細胞[13-14]：將皮膚切成0.2cm×0.2cm大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿中，每皿3～4 塊，加適量培養液，氫化可的松+青鏈霉素100U/ mL，置于CO₂培養箱(5%CO₂，飽和濕度，37℃)中培養，每兩天換液一次。組織塊法分離得到的毛囊干細胞純度低于消化法，細胞生長比率低，細胞不易融合。但獲得的干細胞歷代倍增后仍處于增殖態勢，其原因可能是從組織塊中遷移出來其他種類的細胞可為干細胞營造一個類似于體內的微環境，使干細胞受到的損害小。

3.4差速貼壁法純化毛囊干細胞[15-16]：應用酶消化法分離得到細胞后離心收集細胞接種于IV 型膠原包被的培養皿中。收集上層未貼附角質形成細胞和毛囊真皮成纖維細胞于另一皿中培養， 培養液為20%血清的DMEM ，每2天換液，收集條件培養基。貼附皿底的毛囊干細胞加無血清的DMEM條件培養液培養，每3天換液?？寺⌒纬稍囼炞C實分離出來的干細胞純度大于90% ，克隆形成能力最強的細胞粘附到Ⅳ型膠原等細胞外基質的速度最快[17]。此法將酶消化法得到的細胞進一步純化，得到純度高的毛囊干細胞，目前被普遍應用。

3.5顯微分離技術分離純化毛囊干細胞[18]:將皮膚樣品置入分離酶中4℃消化。從脂肪端拉出毛囊，收集形態完好且處于生長期的毛囊，體視顯微鏡下切取毛囊隆突部，含雙抗磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加入DMEM/F12補充培養基于37℃、5%CO₂孵箱中培養，每3天換液。此法利用解剖學獲取毛囊干細胞富集區對毛囊干細胞進行分離。但獲得的毛囊干細胞純度不高。

3.6聯用顯微分離培養與免疫磁珠法[19]：顯微分離培養獲得毛囊隆突區細胞，應用免疫磁珠純化毛囊隆突區細胞中CD200陽性的毛囊干細胞可獲得高純度毛囊干細胞，且細胞活性不受影響。1990 年，Morris等[20]應用密度梯度離心方法分離小鼠表皮干細胞。因為用這種方法不能得到高純度的干細胞，后來很少有人再采用這種方法。

4毛囊干細胞的識別

4.1毛囊干細胞的組織學形態特征：毛囊干細胞在光鏡下呈立方形，細胞體積小，核漿比大，表面光滑，皺折少，又被稱為非鋸齒形細胞，細胞體積的增大與增殖能力呈負相關。超微結構顯示胞內含有大量游離核糖體而缺乏角蛋白纖維，細胞表面有少許微絨毛，細胞核存在許多卷曲，染色質彌散分布，明顯不同于周圍的細胞，這些形態特征均表現出原始細胞的特性。倒置顯微鏡下觀察可見培養早期的細胞呈圓形，折光性強，表現為鋪路石狀；細胞大小一致，核大而明顯，多偏居于細胞一側，可見雙核細胞及分裂相細胞。細胞之間連接緊密，明顯分層，隨后增殖的細胞亦表現相同的形態。培養2周后，遠離組織的細胞形態發生改變，逐漸伸長呈橢圓形，繼續培養可見細胞皺縮，胞漿內出現黑色顆粒及細小空泡，細胞折光性降低，并有細胞裂解、死亡。

4.2標記滯留細胞：毛囊干細胞最重要的特點之一就是慢周期性，而且可以有無限多次細胞周期[2]。當暴露于帶有其他標記的核苷酸例如[3H]-T 或BrdU時，細胞在DNA 合成的過程中攝取標記核苷酸而將標記整合于DNA中。4～8 周后快速分裂的短暫增殖細胞(transit amplifying cells，TAC)丟失了大量標記，而由于干細胞的細胞周期長，這樣的標記可以維持相當長的一段時間，因此有人稱它為標記滯留細胞(label-retaining cell，LRC)，是迄今為止識別毛囊干細胞最可靠的方法之一。這種方法由Bickenbach[21]1981年首先提出，現已成為公認的識別毛囊干細胞的方法，并被當作探索新的識別方法的參照標準。

4.3細胞克隆形成率：毛囊干細胞是毛發中的原始細胞，其分化經[22]毛囊干細胞、TAC和有絲分裂后分化細胞(postmitotic differentiating cells，PDC) 三個階段[17]。用克隆形成能力來鑒別毛囊干細胞，大而活躍生長的克隆是干細胞形成的，僅分裂很少次數就進入終末分化的細胞被認為是TAC。細胞的集聚是由于其低運動性，反映了干細胞較TAC更大的細胞間粘附力，是整合素高水平表達的結果。

4.4毛囊干細胞標記物：為了對毛囊干細胞進行體外研究，尋找特異的干細胞標記物對干細胞分離培養尤為重要，毛囊干細胞尚無特定的表面標記物。目前已知高表達的分子有K15、K19、整合素、CD200及CD34等[23]，K19一般認為毛囊的隆突部干細胞及胎兒、新生兒表皮基底層干細胞均表達K19， 成人無毛發皮膚如手掌、腳掌部位基底層的干細胞K19表達陽性，但有毛發皮膚基底層中的表皮干細胞K19表達為陰性而毛囊隆突部細胞K19表達為陽性，與LRC位置一致。雙重標記研究證實，隆突部中K19陽性細胞是LRC，具有干細胞的慢周期性，但K19是否能標記全部表皮干細胞仍有待進一步研究[24]。毛囊隆突部中K15陽性細胞亦為LRC，并且表達整和素的水平明顯高于毛囊外根鞘周圍細胞。進一步研究發現，在毛囊干細胞分化過程中，K15表達減少較K19出現更早， 據此推斷K15表達量下降可能是細胞向TAC分化的最早征象之一，K15陰性而K19陽性的細胞可能是“早期”TAC，提示K15可能較K19在鑒別毛囊干細胞更有意義[25]。β1整合素表達于表皮基底層和毛囊隆突部。在人類的表皮，β1整合素的高水平表達是毛囊干細胞的標記，但并非所有的β1整合素陽性細胞都是干細胞，TAC也有表達。p63被認為是毛囊干細胞的標志之一。p63是腫瘤抑制因子之一，是p53的同族體，結構和功能與之類似。Pellegrini等[26]發現在角膜緣的基底細胞有p63表達，而在角膜表面的TAC沒有p63表達，因而認為p63是表皮干細胞的標志物，但p63在毛發基質中亦有表達。CD34是造血干細胞特異性標記物，最近研究發現其在隆突部高表達[27]，在鼠毛囊中檢測發現CD34與LRC和K15陽性細胞在毛囊處位置一致。Trempus提出CD34可能是鼠毛囊干細胞最特異的標記物[28]，盡管CD34也在真皮細胞中表達，但CD34是細胞表面蛋白，應用抗CD34抗體標記可通過熒光激活細胞分類法收集活性隆突部細胞，但有研究表明在人毛囊隆突部中發現其表達下降或缺失，而CD200 陽性細胞表現出更高的克隆形成率[29]，在鼠毛囊外根鞘細胞中也有CD200 表達[30]。CD200 是一種I型膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，受體表達在巨噬細胞表面及T細胞亞群上[31]。CD200與CD200受體間的相互作用可以傳遞抑制性信號減低髓樣細胞的活性，改變其遷移，在免疫疾病和抑制排斥反應中作為一種免疫耐受信號[32]， 提示未來幾年對于人毛囊及毛囊干細胞的免疫研究將成為新的熱點[33]。單克隆抗體C8/ 144B，最初用于抗T細胞蛋白CD8的羧基末端肽，可選擇性地表達于毛囊隆突部的角質形成細胞及淋巴細胞亞群。在C8/144B染色陽性部位，β1整合素、K15和K19均陽性表達，故單克隆抗體C8/144B被認為是識別毛囊干細胞的一個標記物[34]。單克隆抗體H4僅表達于毛囊隆突部，亦被認為是毛囊干細胞的標記物之一。在分離純化毛囊干細胞前加入以上標記物的相應抗體并染色，分離純化后應用免疫細胞化學、免疫組織化學、原位雜交、熒光標記識別及同焦點顯微鏡檢測法已成為對毛囊干細胞進行識別鑒定的主要方法。

4.5 RT-PCR檢測技術的應用[12，35]：抽提分離得到細胞總的mRNA，進行RT-PCR反應，在特定的條件下對毛囊干細胞的標記物如K15、K19等進行逆轉錄，所得產物電泳條帶與Marker 條帶位置進行比較，判斷細胞內標記物的含量。此方法也可對體外培養干細胞傳代情況的判斷。

對毛囊干細胞的識別目前沒有公認的特異的方法，因此需要聯合應用以上方法對分離純化的毛囊干細胞進行識別并對毛囊干細胞體外傳代情況進行檢測。

5問題與展望

目前對于毛囊干細胞的研究已取得的了很大進步，但對分離純化及識別方法的研究仍存在著許多問題：

5.1沒有規范的分離純化方法，分離純化毛囊干細胞的純度不足：目前分離純化毛囊干細胞的技術較多，但沒有公認的純度高的分離純化方法，應用目前常用分離純化的方法分離毛囊干細胞的純度大約在50%～90%之間[13]，組織塊法分離的毛囊干細胞純度較低，約在50%左右，應用差速貼壁法純化毛囊干細胞可獲得純度為90%以上的毛囊干細胞[16]。

5.2 分離的毛囊干細胞體外傳代培養幾代后其增殖能力下降[13]：消化法獲得的干細胞經歷倍增期后，生長速度減慢，進入平臺期。免疫組化染色和克隆形成率結果顯示，第3 代、7 代組織塊法免疫組化陽性率和克隆形成率明顯高于消化法，兩種方法之間差異極顯著(P<0.01)。從傳代次數來看，消化法第12代細胞已出現老化現象，其原因可能是酶消化破壞了干細胞與微環境的聯系，影響了干細胞的生物學特性。

5.3標記物的選擇：毛囊干細胞雖然有多種標記物，但缺乏特異性。一般認為β1-整合素陽性細胞包含了干細胞和早期TAC[36]；在毛囊生長期K19陽性細胞不僅大量表達于毛囊隆突部，也存在于其下方的毛球部，進入退行期和靜止期，隨著毛球部萎縮， K19 陽性細胞消失，而毛囊外根鞘部位依然存在K19 陽性細胞。因此，只能通過聯合使用標記物以提高特異性。

5.4加入干細胞標記物相應抗體后進行傳代是否會影響其增殖能力：目前，還沒有關于加入毛囊干細胞相應抗體后是否影響其增殖能力的報道，但這些標記物本身是毛囊干細胞的組成成分，在細胞的增殖和分化過程中起一定作用，當我們應用其相應抗體與之結合時必將影響標記物作用的發揮，有可能會影響毛囊干細胞的體外增殖與傳代的能力。

隨著研究的深入，相信在不久的將來定能解決上述問題，應用純度高、增殖能力強的毛囊干細胞在特定的條件下進行分化并應用于臨床。

[參考文獻]

[1]Wakayamat，Tabarv，Rodriguez I，et al.Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer[J].Science，2001，292(5517):740-743.

[2]George Cotsarelis.Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells[J].Clin Invest，2006，116(1):19-20.

[3]Cotsarelis G，Sun TT，Lavker RM.Label-retaining cells reside in the bulge area of pilo sebaceous unit: Implications for follicular stem cells，hair cycle，and sk- in carcinogenesis[J].Cell，1990，61(3):1329.

[4]Taylor G，Lehrer MS，Jensen PJ，et al.Involvement of follicular stem cell in forming not only the follicle but also the epidermis[J].Cell，2000，102(4):451-461.

[5]Lavker RM，Sun TT.Epidermal stem cells:properties，markers，and location[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25):13473-13475.

[6]Lyle S，Christofidou-Solomidou M，Liu Y，et al.Human hair follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype[J].J Invest Dermatol，1999，4(3):296-301.

[7]Moll I.Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicle[J].J Invest Dermatol，1995，105(1):14-21.

[8]Commo S，Gaillard O，Bernard BA.The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath:a unifying hypothesis for stem cell reservoir[J]? Differentiation，2000，66(425):157-164.

[9]Potten CS.Booths C1 Keratinocyte stem cells : a commentary[J].J Invest Dermatol Symp Proc，2002，119:888.

[10]Fuchs E，Tumbar T，Guasch G，et al.Socializing with their neigbors:stem cells and their niche[J].Cell，2004，116:769-778.

[11]Yang JS，Lavker RM，Sun TT.Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential [J].J Invest Dermatol，1993，101(5):652-659.

[12]張群，叢笑倩，張文杰，等.利用中性蛋白酶消化法擴增毛囊干細胞的實驗研究[J].上海交通大學學報（醫學版），2007，27(4):387-391.

[13]史明艷，楊學義，竇忠英.山羊毛囊干細胞分離培養方法研究[J].畜牧獸醫學報，2006，37（5）:436-440.

[14]唐建兵，李 勤，陳 璧，等.兩種人毛囊外根鞘細胞培養方法的比較[J].廣東醫學，2005，26（1）：44-45.

[15]Jones PH，Watt FM.Separation of human epidermal stem cells for transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell，1993，73:713-724.

[16]張 群，楊光輝，叢笑倩，等.差速貼壁法分選人毛囊干細胞的研究[J].中華實驗外科雜志，2006，23（6）：755-757.

[17]Jones PH，Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell，1993，73(4):713.

[18]Zhang Y，Xiang M，Wang Y，et al.Bulge cells of human hair follicles:segregation， cultivation and properties. Colloids Surf B Biointerfaces，2006，47(1):50-56.

[19]譚 挺，胡志奇，周洪軍.顯微分離培養與免疫磁珠法分離純化人毛囊干細[J].中國修復重建外科雜志，2008，22（2）:202-205.

[20]Morris RJ，Fischer SM，Klein Szanto AJ，et al.Subpopulations of primary adult murine epidermal basal cells sedimented on densitygradients[J].Cell Tissue Kinet，1990，23(6):587.

[21]Bickenbach JR.Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin[J].J Dent Res ，1981，60:1611.

[22]Tani H，Morris RJ，Kaur P.Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype[J ].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(20):10960.

[23]李睿書，王石泉.毛囊干細胞[J].細胞生物學雜志，2007，29:457-462.

[24]Michel M，L Heureux N，Auger FA，et al.From newborn to adult: pheno typic and functional properties of skin equivalent and human skin as a function of donorage[J].J Cell Physio l，1997，171(2):179-189.

[25]Lyle S，Christofidou Solomidou M，Liu Y，et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci，1998，111(21):3179-3188.

[26]Pellegrini G，Dellambra E，Golisano O，et al.p63 identifies keratinocyte stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U SA，2001，98(6):3156.

[27]Trempus CS，Morris RJ，Bortner CD，et al.Enrichment forliving murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].J Invest Dermatol，2003，120(4):501-511.

[28]Carol S，Trempus1，Rebecca J.Morris，CD34 Expression by Hair Follicle Stem Cells Is Required for Skin Tumor Development in Mice[J].Cancer Res，2007，67(9):4173-4181.

[29]Ohyama M，Terunuma A，Tock CL，et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest，2006，116(1):249-260.

[30]Rosenblum MD，Olasz EB，Yancey KB，et al.Expression of CD200 on epithelial cells of the murine hair follicle: a role in tissue-specific immune to lerance[J]? J Invest Dermato，2004，123(5):880-887.

[31]Michael D，Rosenblum， Edit B， et al.Truitt Expression of CD200 on Epithelial Cells of the Murine Hair Follicle: A Role in Tissue-Specific Immune Tolerance[J]? J Invest Dermatol，2004，123:880-887.

[32]Cotsarelis G.Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells[J].J Clin Invest，2006，116(1):19-22.

[33]Stephen Lyle1，Melpo Christofidou-Solomidou，Yaping Liu，et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci，1998， 111:3179-3188.

[34]楊 恬，向明明.一組毛囊真皮乳頭細胞的單克隆抗體[J].解剖學報，2000，31（3）:277-279.

[35]Hong Yu，Dong Fang，Suresh M，et al.Isolation of a Novel Population of Multipotent Adult Stem Cells from Human Hair Follicles[J].AJP，2006，168(6):1881.

[36]耿松梅，王劍利，王萬卷，等.毛囊干細胞定位和體外向表皮分化[J].中國醫學科學院學報，2006，28（3）:360-362.

[收稿日期]2008-05-22[修回日期]2008-07-28

編輯/李陽利