人工神經血管化研究的進展

王 嵐 邢 新 沈尊理

·綜述·

人工神經血管化研究的進展

王 嵐 邢 新 沈尊理

周圍神經損傷后，缺損的替代修復是目前臨床上尚未完全解決的問題。目前主要的修復方法是自體神經游離移植，該方法療效較為肯定，但存在供體來源有限，且易造成供區感覺或功能障礙、神經瘤的形成、手術難度高以及軸突錯位生長等問題。因此，應用人工神經移植物作為支架，修復周圍神經缺損成為近年來周圍神經領域的研究熱點，并已取得了可喜發展。現在，不僅能在體外培養擴增多種種子細胞，而且能將培養的細胞與各種生物材料復合，植入體內以達到恢復周圍神經功能的目的。然而，到目前為止，人工神經移植尚不能完全與自體神經移植的效果相媲美，如神經缺損超過一定的長度或所需修復的神經較粗大時，或有肌腱、骨外露等血供不良創面時，修復效果差。可能的原因為組織工程人工神經移植體再血管化延遲，在早期不能及時建立內在的血液循環，部分種子細胞由于缺血缺氧而死亡，影響神經再生質量。進一步的基礎研究發現，細胞在血管周圍150～200 μm內才能通過彌散來維持存活，否則移植體內部的細胞將難以通過滲透作用獲得營養和氧分的支持。因此，組織工程人工神經內必須要有毛細血管的長入才能維持種子細胞正常的代謝[1]。目前，組織工程人工神經早期血管化問題日益受到學者們的關注。

1 周圍神經再生與再生微環境及局部血供

周圍神經損傷后，末梢側靶組織分泌神經生長因子等生物活性物質，誘導中樞側的神經出芽再生，神經軸突由近端沿許旺細胞鞘膜的方向漸次延伸，達到神經末梢。周圍神經再生的調控是一個復雜的過程，由多因素共同參與。受損局部（包括近、遠端的斷端）會釋放一系列內源性生長因子，促進神經再生。這些誘導和促進神經生長的因子包括，神經營養因子家族、軸突生長促進因子、作用于許旺細胞的因子等，它們是神經軸突生長、許旺細胞遷移生長并形成髓鞘所不可或缺的[3－4]。細胞外基質（ECM）如纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等在細胞的粘附和移行過程中發揮重要的作用。層粘連蛋白是基底膜的成分之一，能夠引導和促進軸突長入基底膜支架，同時促使巨噬細胞移出移植物。纖維粘連蛋白也能促進軸突再生并能夠抑制成纖維細胞過度浸潤。某些激素，如胰島素、甲狀腺素等也參與其中[5－6]。周圍神經的血供有兩種形式：即外部縱形血管和內部叢狀血管。Hirasawa發現神經移植后，血管再形成有兩種形式：神經外形式出現在移植后3～6周內，為縱形血管；神經內形式即叢狀血管系統，可持續24周。不帶血管的神經移植術后3 d為缺血狀態，術后1周發生急劇的血流增加。而帶血管的神經移植早期雖也有血流升高，但基本處于平穩狀態[7－8]，這對于保持神經內微環境的恒定可能有一定意義。周圍神經損傷后，軸突和髓鞘的潰變產物是吸引巨噬細胞聚集的主要物質[9]。來源于血液中的巨噬細胞能使移植體內殘留的組織碎片得到較快清除，為軸突向遠端生長打開通道[10]，為神經軸索再生，迅速長入Bungner帶，提供了有利條件。帶血管的神經移植的血流持續平穩，維持了許旺細胞的營養物質。調整局部神經再生的微環境，對促進神經再生十分重要，而這又與局部血供密切相關。

2 血管新生的相關機制

根據血管再生中內皮細胞的來源不同，可將血管新生（Neovascularization）分成血管形成（Vasculogenesis）和血管生成（Angiogenesis）兩種形式。血管形成，指血管內皮細胞來源于其前體細胞，即內皮祖細胞（EPC）或血管母細胞，這種血管形成方式主要是指在胚胎發育時，由中胚層的成血管細胞發育成血管系統。血管生成，是指血管的生長來源于已經存在的成熟血管內皮細胞，通過出芽及微血管融合生長等方式來進行的。以往認為，血管形成只限于胚胎，血管生成只存在于成體，隨著成體來源的EPC在體外分離成功，證明血管形成也發生在成體階段，主要參與重癥缺血區域血管的新生。

血管新生均由生長因子、細胞和細胞外基質（ECM）間的相互作用所調控的。生長因子包括血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素（Angiopoietin，Ang）、成纖維細胞生長因子（FGF）、轉化生長因子β（TGF－β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等。其中，VEGF和Ang是兩種最重要的促血管生成因子，在血管的新生中二者協同作用，VEGF促進原始血管網的形成，而Ang則作用于隨后的血管改建塑形，促進形成成熟且有空間結構的血管網。細胞外基質包括整合素αγβ3、基質－細胞蛋白、蛋白水解酶等可促進新生血管形成和穩定以及血管內皮細胞的遷移。

3 人工神經的血管化策略

3.1 人工神經導管材料的修飾

人工神經血管化的最終目的，是在導管內形成有功能的血管網。這就要求導管材料與血管內皮細胞有良好的組織相容性，并能促進毛細血管的長入[14]。對材料進行修飾，主要包括內部支架的建立和外部多孔狀結構的構建。適宜的內外部結構可以支持種子細胞的分化和軸突再生，支持細胞的貼附，防止結締組織長入，同時可以在導管表面固定添加一些促進血管內皮細胞粘附和增殖的物質如：膠原、纖維結合素、層粘連蛋白等。現在的人工神經導管一般選擇孔隙率為70%，孔徑20～40 μm的半滲透性導管，以利于血管的長入和營養物質的滲入[15]。

3.2 在人工神經導管內置入緩釋的生長因子

在人工神經導管內置入緩釋的復合生長因子，可以誘導血管內皮細胞向材料內部遷移、增殖從而形成毛細血管網。直接誘導血管內皮細胞分裂、增殖和遷移的生長因子主要有VEGF、FGF家族；體內能間接促進血管形成的生長因子有TGF-β、PDGF和Ang[16]。后者主要作用是促進血管周細胞和平滑肌細胞的分裂、增殖和遷移。

3.3 血管內皮細胞與種子細胞聯合培養

血管內皮細胞種植在材料內可增殖分化形成血管。Sahota等[17]將人真皮微血管內皮細胞接種到可降解的支架上，植入裸鼠體內，1 d后發現內皮細胞在支架內遷移，5 d后形成毛細血管樣管道，1周后形成了微血管，3周就與宿主的血管相連通。

3.4 體內血管網包裹

Zhang等[18]研究表明，大網膜脂細胞能合成血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，大網膜微血管內皮細胞能合成堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)。目前實驗已證實，VEGF和bFGF是強有力的促血管生長因子[19－20]。周建生等[2]利用帶蒂大網膜移位包裹人工神經移植體，在術后3 d出現再血管化，7 d、14 d再血管化程度逐漸增強，促進其早期再血管化。

3.5 血管束植入

為了改善移植神經的血供，1976年Taylor等提出了吻合血管的神經移植，應用帶橈動、靜脈的橈神經淺支修復正中神經缺損，取得了成功。但在臨床上，由于帶血供的血管化神經供區有限，1994年Cavadas等進行了植入血管束預制血管化神經的研究。張媛媛等[21]利用兔右耳的中央動靜脈束植入面神經上頰支，人為地形成一條帶血管的神經移植體，在神經移植過程中保持了血液供應的連續性，為神經軸索再生及迅速長入Bungner帶，提供了有利條件。研究發現，實驗組在術后6周、8周、10周，髓鞘厚度和神經纖維直徑均優于對照組；術后神經傳導速度恢復快，遠端肌肉和運動終板恢復快，SDH和AchE升高迅速。神經血管束的植入方法相對血管網包裹而言可能具有更大的優點，比較符合生理上神經血供特點，植入材料內部后縮短了再血管化的距離和時間，而且可以形成以植入血管束為蒂的帶蒂的人工神經。

3.6 體外構建血管網

1998年，Shinoka等[37]用Polyglatin/PGA制成管狀支架，從羊頸總動脈或頸外靜脈取EC、SMC、FB，體外培養2周后種植于支架上，繼續孵育7 d后，細胞在支架融成片狀，即移植于羊的肺動脈，11周后支架完全降解，管壁內膠原蛋白含量為正常自體肺動脈的73%左右，管壁中膜有彈性纖維生成，內膜有ES特有的Ⅷ因子存在；管壁中鈣含量高于鄰近的自體肺動脈，但無大塊鈣化組織出現。該實驗中，PGA材料的機械支撐力較弱，可用于低壓的肺循環，但置于壓力較高的體循環中，則可能形成動脈瘤。1998年，L’Heureux等[38]分別將人臍靜脈SMC和人皮膚下FB于培養瓶中培養，,30 d后形成由細胞和ECM構成的膜片，,將膜片從瓶壁上剝離，包裹在惰性管軸外繼續培養。在成熟期，膜片相互緊密粘接，形成圓柱狀培養物。將FB管膜經脫水處理后制成無細胞內膜，然后分步組裝：先將內膜套在聚四氟乙烯多孔管軸(外徑3 mm)外，再裹上SMC膜片制為中膜，此時將構制物置于生物反應器中，將培養液同時通過管腔和管外進行回流培養，然后再裹上FB膜作為外膜，最后取出中心管軸，于管內接種EC，于3個月后構制成具有活性細胞、有類似機體血管板層結構的組織工程血管。其中的SMC和EC均表現分化狀態，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg（7.5 mmHg=1 KPa）的靜水壓，其移植于體內的長期通暢率和穩定性等則有待進一步觀察。在3個月時，膠原蛋白的含量為相應自體腹主動脈的25%左右，至5個月增加到99%；中膜有大量彈力纖維生成，內膜有平整的EC。隨著時間延長，其機構拉力曲線逐漸與自體腹主動脈相一致，并且在中膜發現有金屬蛋白酶(MMP22)，這是種明膠酶，可分解膠原蛋白，表明組織工程血管的膠原組織處于動態平衡的狀態。2001年，熊猛等[39]將培養3～7代的牛主動脈的EC接種于PGA上，旋轉動態培養10 d，結果形成較完整的內膜層，復蓋率達91%左右，前列環素生成率為4.6%，培養血管的ECⅧ因子相關抗原抗體染色呈陽性，EC在管腔內表面貼附良好，細胞相互融合成片。

4 展望

目前采用的組織工程血管化的方法或多或少地存在一些問題，例如在材料內復合生長因子的使用量、緩釋的速度調控、誘導形成的血管的成熟程度，以及種子細胞基因突變等安全性問題，都需要進一步的研究。利用宿主體內的血管進行血管化，因血管長入需要一定時間，導致構建組織的大小受到限制。體外構造血管網是一種非常有前景的方法，但其難度大，有很多的技術問題需要解決，比如如何獲得非常大量的內皮細胞，形成的血管網在體外怎樣保持其有效的生理功能等。相信隨著對血管化的形成和調控機制分子水平的基礎研究不斷深入，以及各種技術手段不斷發展、完善，最終會找到比較理想化的人工神經血管化的方法。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）－01－0049－03

2008年7月24日；

2008年10月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.015

200080上海市上海交通大學附屬第一人民醫院整形科（王嵐，沈尊理）；200433上海市第二軍醫大學附屬長海醫院整形科（邢新）。