花椰菜最適ISSR反應體系的建立及優(yōu)化

陳海英 羅天寬 張小玲 唐征 劉慶

（溫州科技職業(yè)學院農(nóng)業(yè)與生物技術系，浙江溫州，325006）

花椰菜最適ISSR反應體系的建立及優(yōu)化

陳海英 羅天寬 張小玲 唐征 劉慶

（溫州科技職業(yè)學院農(nóng)業(yè)與生物技術系，浙江溫州，325006）

以花椰菜9901A×9908雜交種為材料，用高鹽低pH值法提取的基因組DNA為模板，對ISSR-PCR反應體系中的鎂離子濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶量、引物用量以及最適退火溫度等影響因子進行了優(yōu)化和篩選，建立了適合花椰菜的ISSR反應體系：20 μL PCR反應體系，含10×PCR反應緩沖液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因組DNA約30 ng，最適退火溫度為52.8℃。

花椰菜 ISSR 反應體系 優(yōu)化

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）別名花菜、菜花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，屬一、二年生草本植物，起源中心為地中海東部沿岸，19世紀中葉傳入中國南方，是重要的蔬菜作物。花椰菜營養(yǎng)豐富，據(jù)日本癌癥預防研究所對20種蔬菜食品的抗癌成分及抑癌試驗結(jié)果分析，花椰菜含有多種吲哚衍生物，具有明顯的抗癌作用[1]。花椰菜是由野生甘藍進化而來，由于生長習性的演變和階段性的變異，經(jīng)不同環(huán)境條件和不同目標的選擇和培育而形成的變種，是生物學研究的很好試材；加之其營養(yǎng)豐富，適應性廣，在我國分布地區(qū)很廣，因而也成為育種者和消費者都十分喜愛的蔬菜[2～3]。

ISSR標記是一項以SSR區(qū)域為引物結(jié)合區(qū)，以SSR間區(qū)為擴增區(qū)的分子標記技術，其多態(tài)性是來源于擴增區(qū)的DNA片段長度多態(tài)性。ISSR不象SSR具有物種特異性，其引物為隨機引物，故可以像RAPD一樣用于各種植物的研究。ISSR標記結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點，具有模板需要量少，多態(tài)性豐富，無需試劑盒，試驗成本低，操作簡單，試驗穩(wěn)定性高等優(yōu)點[4]。ISSR技術現(xiàn)已廣泛應用于大麥、小麥、水稻、馬鈴薯等農(nóng)作物的研究[4～6]。本研究應用ISSR分析方法，以花椰菜基因組DNA為材料，探討ISSR-PCR反應體系中各種因素對其擴增的影響，通過單因素試驗確定Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶和引物在花椰菜ISSR-PCR反應體系中的最適宜濃度，獲得花椰菜ISSR反應的最佳體系，旨在為花椰菜種質(zhì)資源的科學利用和分子標記輔助育種等方面提供技術支持。

表1 ISSR反應體系優(yōu)化設計

圖1 退火溫度對花椰菜ISSR擴增的影響

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為花椰菜9901A×9908雜交種處于旺盛營養(yǎng)生長期的葉片，采樣后將葉片裝于紙袋中，置于-70℃低溫冰箱保存，用于DNA提取。

1.2 試驗方法

①基因組DNA的提取和純化 花椰菜基因組DNA的提取，采用改進的高鹽低pH值法[7]。取低溫保存的葉片約0.2 g，于1.5 mL離心管中，加入液氮迅速研磨成粉末，立即加入800 μL 65℃預熱的高鹽低pH值提取緩沖液，充分混勻，65℃保溫30～60 min，不時搖晃混勻。加入300 μL的5 mol/L NaAc（pH值5.2）溶液，于-20℃放置20 min后，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)至另一管中，加入0.6倍體積的異丙醇，小心混勻，靜置5 min。12 000 r/min離心10 min，傾去上清液得DNA沉淀。沉淀用70%乙醇洗滌2次，風干后溶于500 μL無菌水中，再加入15 μL RNase A（2.5 mg/mL），于37℃保溫30 min，加入1/5體積的3 mol/L NaAc（pH值5.2）和0.6倍體積的異丙醇，12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌2次，風干后溶于150 μL無菌水中，-20℃冰箱保存。

②ISSR擴增反應單因素篩選 ISSR擴增反應采用20 μL反應體系，其中25 mmol/L Mg2＋1.8 μL，10mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 ng/μL引物1 μL，模板約30 ng，滅菌水12.5 μL。試驗初始反應程序為：94℃預變性5 min，然 后 進 入 循 環(huán) ：94℃ 1 min，50℃ 復 性1 min，72℃延伸1.5 min，經(jīng)40個循環(huán)，再經(jīng)72℃延伸10 min后，于5℃保溫。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中分離，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)（Electrophoresis Image Analysis System，F(xiàn)R-980）中拍照并保存。

圖2 引物濃度對ISSR擴增的影響

③ISSR PCR中退火溫度的確定和反應體系的優(yōu)化 進行PCR擴增時采用梯度PCR儀（eppendorf），根據(jù)引物的Tm值在45～55℃自動設置12個溫度梯度。PCR反應參考劉沖等[8]的方法進行，20 μL反應體系中，反應因素dNTP，Taq酶、Mg2＋以及引物的濃度等幾個關鍵因子的變化進行條件優(yōu)化，各參數(shù)分別設置5～7個濃度水平（表1），采用篩選的引物ISSR17（表1），進行PCR擴增條件的優(yōu)化。試驗中，對ISSR擴增反應某一成分設置梯度進行篩選時，保持其他成分不變，調(diào)整雙蒸水用量使其總體積保持不變。

④數(shù)據(jù)處理與分析 應用復日Smart View TM生物電泳圖像分析軟件對凝膠圖譜片段進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度的確定

在進行ISSR擴增優(yōu)化之前確定引物的退火溫度非常重要，退火溫度不僅與引物序列有關，還與物種DNA的序列有密切關系。先參照李鈞敏等[9]的PCR反應條件進行引物的初篩，選擇能看到清晰條帶的引物ISSR17進行退火溫度的確定。結(jié)果表明，退火溫度對ISSR-PCR的影響非常明顯：在45～49.7℃范圍內(nèi)，擴增條帶數(shù)較少，模糊；在50.4～55℃范圍內(nèi)，擴增條帶增多，條帶清晰，亮度較大（圖1）。引物ISSR17根據(jù)公式Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T）計算的退火溫度為50℃，而本研究中，最適的退火溫度為52.8～54.5℃，我們選擇靠近Tm的52.8℃為花椰菜的最適溫度。

圖3 Mg2＋濃度對ISSR擴增的影響

圖4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

2.2 引物濃度對ISSR擴增的影響

本研究設定了5個引物濃度梯度（圖2），當加入引物量為0.4～0.6 μmol/L時，擴增的帶型比較穩(wěn)定一致，但從穩(wěn)定性和擴增條帶的強度來看濃度為0.5 μmol/L時，能擴增出比其他更清晰穩(wěn)定的條帶，因此把它作為最佳濃度。而當濃度增大到0.7 μmol/L時，主帶減弱，條帶變得模糊，背景加深（圖2）。

2.3 Mg2＋濃度對ISSR擴增的影響

Mg2＋離子濃度是影響PCR結(jié)果的一個主要變化因素，它不僅影響Taq酶活性，還能與反應液中的dNTPs、模板DNA及引物結(jié)合影響引物與模板的結(jié)合效率[7]。本研究設置了7個Mg2＋濃度梯度，Mg2＋濃度對擴增的條帶有明顯的影響，當 Mg2＋濃度在 1.5～2.0 mmol/L時，擴增條帶比較清晰、亮度較大，而且背景明顯；但當濃度在2.25～3.0 mmol/L時，擴增條帶呈彌散趨勢，圖象顯得不清晰。故取2.0 mmol/L為最適濃度（圖3）。

2.4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

dNTPs是PCR反應的原料，濃度過高會產(chǎn)生錯誤滲入，濃度太低導致產(chǎn)率太低，通常dNTPs濃度在0.02～0.20 mmol/L[10]。本試驗設置了5個dNTPs濃度梯度（圖4），當dNTPs為0.2 mmol/L和0.25 mmol/L時擴增條帶清晰穩(wěn)定，且重復性高，本研究采用dNTPs的最適濃度為0.2 mmol/L。

圖5 TaqDNA聚合酶對ISSR擴增的影響

2.5 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

Taq酶的使用量也是影響PCR的一個重要因素，高濃度的Taq酶不僅成本較高，而且容易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物，Taq酶濃度過低則會導致產(chǎn)物的合成效率下降[11]。本試驗設置了5個Taq酶濃度梯度（圖5），結(jié)果在20 μL的反應體系中，Taq酶用量為0.5 U時，擴增產(chǎn)物出現(xiàn)條帶少；Taq酶用量為1.0～1.5 U時Taq酶擴增的條帶清晰，且隨濃度的升高，條帶亮度略有增加；Taq酶用量為2.0～2.5 U時，擴增條帶呈彌散趨勢。因此，本研究選用1.5 U的Taq酶為最佳用量。

3 小結(jié)與討論

隨著分子生物學的應用和發(fā)展，分子標記技術（RAPD，ISSR，SSR，RFLP，AFLP，SRAP等）已成為作物品種改良的先導技術。分子標記技術具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境影響等優(yōu)點，已開始廣泛應用于蔬菜作物品種鑒定與純度檢測中[11～12]。

ISSR是基于PCR擴增反應篩選DNA多態(tài)性的一種分子標記技術，因而影響PCR擴增反應的各種因素（如模板DNA、Taq酶、dNTP、Mg2＋以及引物等）同樣影響ISSR的擴增效果[13]。因此，在研究時都應先建立起合適的反應體系并對其進行優(yōu)化，以獲得重復性和可靠性較高的ISSR譜帶。本研究結(jié)果確定了適合花椰菜9901A×9908雜交種的最適ISSR-PCR反應體系為：20 μL反應體積，含10×PCR反應緩沖液2 μL，2.0 mmol/L MgCl2，4×dNTP混合物0.2 mmol/L，引物0.5 μmol/L，Taq酶1.5 U，基因組DNA約30 ng。反應程序為：94℃預變性5 min，然后進入循環(huán)：94℃ 1 min，52.8℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，經(jīng)40個循環(huán)，再經(jīng)72℃延伸10 min后，于5℃保溫，建立了穩(wěn)定的花椰菜ISSR反應體系。

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Establishment and Optimization of ISSR Reaction System in Cauliflower

CHEN Haiying,LUO Tiankuan,ZHANG Xiaoling,TANG Zheng,LIU Qing
(Department of Agriculture and Biotechnology,Wenzhou Vocational College of Science and Technology,Wenzhou 325006）

The effect of Mg2+,dNTP,primer,Taq DNA polymerase and annealing temperature on ISSR-PCR amplification reaction were studied using the genomic DNA as template,extracted with low pH,high-salt method in cauliflower.The results showed that the conditions suitable for ISSR-PCR were as follows:2 μL 10×Taq buffer,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,0.5 μmol/L primers,1.5 U Taq DNA polymerase and 30 ng template DNA in total 20 μL reaction volume,and the optimum annealing temperature was 52.8℃.

Cauliflower;ISSR;Reaction system;Optimization

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.12.005

浙南作物育種重點實驗室資助，浙江省科技計劃項目（編號2008C22094）資助

陳海英（1979-），女，博士，講師，從事微生物及分子生物學研究。E-mail：chy2201@163.com

2008-11-21