骨髓間充質干細胞在軟骨組織工程化組織構建中的應用

張　玲　陳長永　王佳琦

張 玲 陳長永 綜述，王佳琦 審校

人骨髓中所含的細胞可以分為造血類細胞和非造血類細胞。前者中含有的干細胞主要為造血干細胞，而后者中含有間充質類干細胞（mesenchymal sten cell）能夠分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪、皮膚和其他類型的細胞[1-2]。骨髓中含有多向分化潛能的細胞，這類細胞的共同特征是具有成纖維細胞的形態，能黏附塑料培養皿，并能形成細胞克隆，但無吞噬功能?；谶@些特征，這類細胞又被稱之為“成纖維細胞樣的克隆形成單位”或“骨髓間質纖維細胞”。隨后的研究發現，在適當的實驗條件下，骨髓間質纖維細胞能夠形成軟骨、骨、脂肪、纖維組織和骨髓間質組織等[3]。由于MSC主要存在于骨髓中，故骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell）或骨髓間質細胞（bone marrow stromal cell）的英文縮寫BMSC已成為一種較為常見的命名方式。理想的軟骨組織工程種子細胞應具備以下特點：易獲取、對機體損傷小、易體外培養增殖、長期傳代不改變生物學特征、具有較強的傳代繁殖力、組織修復能力強、植入體內后能耐受機體免疫、并保持良好的生物相容性。來源于自體骨髓的間充質干細胞完全具備這些特點[4-5]。隨著對BMSCs研究的不斷深入，BMSCs用于醫學領域的巨大潛能逐漸被發掘出來了。本文就骨髓間充質干細胞在軟骨組織工程化組織構建中的應用進行綜述。

1BMSCs定向誘導分化為軟骨細胞的方式

目前，國內外BMSCs定向誘導為軟骨細胞的方式很多，大體可分為體外和體內兩種誘導方式。

1.1 體外誘導：體外誘導包括體外細胞團聚集誘導、體外單層細胞團誘導、體外三維支架環境中誘導與軟骨細胞體外共培養誘導。

1.1.1 體外細胞團聚集誘導：在軟骨發育過程中，前期細胞密度較大，后期細胞密度逐漸降低，所以Brian,Yoo JU[6-7]等把兔BMSC先在含10％DMEM中培養后，消化收集融合的BMSCs，低速離心后移入l5ml聚丙烯試管中，用含10mol/L地塞米松DMEM培養液聚集誘導培養，在7天既檢測到細胞團中有Ⅱ型膠原的分泌；21天細胞團形態類似軟骨組織，體積約2mm3，所有細胞聚集團均有軟骨特異性Ⅱ型膠原分泌，并部分檢測到X型膠原的表達，而不加地塞米松的對照組則無Ⅱ型膠原表達。在DMEM培養液中同時加入TGF-β1時，誘導出的類軟骨組織團體積比前者大。以上研究初步證實TGF-β1、地塞米松在BMSCs向軟骨細胞分化過程中起著重要作用[8-10]，而研究者所采用細胞聚集成團誘導，正是模擬了人體內軟骨發育時的過程，先在將要形成軟骨的部位，中胚層的問充質細胞聚集形成前軟骨細胞團，進一步分化為軟骨細胞。細胞聚集成團，形成內部相對缺氧的環境,可能會有利于BMSCs向軟骨細胞分化。

1.1.2 體外單層細胞誘導：體外細胞團聚集誘導培養形成基質后，可能因為周邊細胞營養充分，細胞團外基質分泌較旺盛，細胞團中心部位細胞由于營養彌散受限而易發生壞死，而且細胞團聚集誘導形成的軟骨樣組織體積非常小，一般僅約2～5mm3，其臨床實用性非常有限，根本無法滿足軟骨缺損修復或體表凹陷缺損的充填，而體外單層誘導培養有可能獲得更多的細胞。Worster[11]等在體外單層培養環境中，對馬的BMSCs單層誘導培養，檢測到軟骨細胞特異性II型膠原，初步證實馬的BMSCs經單層誘導培養已有部分細胞向軟骨細胞分化。Gallay[12]等用含有β1 轉化生長因子（TGF-β1）的培養基培養骨膜MSCs后發現有軟骨細胞形成。Mackay[13]等將人的BMSCs置入含有地塞米松、TGF-β1的培養基中培養14天后，細胞開始分泌Ⅱ型膠原，說明BMSCs已分化為軟骨細胞。夏萬堯等以高糖DMEM低血清含有TGF-β1，地塞米松、胰島素等誘導因子作為誘導培養液，在體外單層培養條件下，誘導豬BMSCs向軟骨細胞表型定向分化，誘導培養后7天免疫組化檢測到II型膠原，原位雜交也檢測到II型膠原mRNA表達；而對照組則不能測到II型膠原的表達。實驗證明BMSCs在體外單層培養誘導下，也能向軟骨細胞分化。Sekiya[14-16]等證明，在含有地塞米松、TGF-β1的培養體系中再加入骨形態發生蛋白-6（BMP-6)會使細胞微團的重量增加10倍以上，產生的基質也更多。Mastrogiacoma[17]等的實驗證實，成纖維細胞生長因子2(FGF2)使BMSCs保持在一種不成熟的狀態中，并有強烈的促增殖作用，同時可誘導MSCs分化成軟骨細胞。

1.1.3 體外三維支架環境中誘導：因為體內細胞都是在三維空間中生長、繁殖、分化并發揮其特定的生物學功能的，在用組織工程技術構建軟骨或修復的過程中，細胞支架可模擬機體的狀態，提供一個穩定的三維空間支架結構，并保持足夠的空隙率，供細胞在其中附著、分化、增殖、物質交換、生長代謝，引導軟骨組織形成，并為細胞自分泌或旁分泌的細胞因子提供暫時的附著點。U1rich[18]等以包埋后聚羥基乙酸(PGA)為載體，在體外應用含TGF-β1，特定培養液定向誘導人BMSCs，結果證實有軟骨樣組織形成，并在蛋白和分子水平檢測到軟骨細胞分泌的II型膠原、IX型膠原。夏萬堯[19-20]等以豬髂骨骨髓中分離得到的BMSCs體外低糖DMEM完全培養液培養2周，傳代后以濃度為5×107/ml細胞懸液均勻接種于管狀PGA支架上，以高糖DMEM低血清特定培養液誘導，連續誘導培養lO周時，BMSCs-PGA復合物外觀呈乳白色軟骨樣，管壁較厚,有一定的彈性，但中間部管腔塌陷較明顯，HE染色見實驗組管狀BMSCs-PGA復合物表層為2～4層成纖維樣細胞樣組成的軟骨膜，下層為較成熟的軟骨組織，軟骨細胞均勻分布，包埋在軟骨陷窩內，結構較致密和規則，免疫組化也證實在形成的軟骨基質中有大量被特異性染成棕黃色顆粒的Ⅱ型膠原分布；而對照組管狀BMSCs-PGA完成解體，僅剩一層薄薄的膜狀組織。此研究結果表明利用BMSCs為種子細胞，復合管狀PGA支架，應用特定的培養液可在體外構建管狀軟骨，這對將來臨床應用BMSCs作為種子細胞，修復軟骨缺損或構建復合組織氣管具有一定的應用前景。王會才[21]等觀察微重力條件下動態三維誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞的分化!并與靜態培養作比較得出結論：立體誘導優于平面誘導，微重力動態培養可提高細胞誘導分化質量。

1.1.4 與軟骨細胞體外共培養誘導：許多研究證實軟骨細胞可分泌多種對BMSCs有誘導作用的生長因子如TGF-β、IGF及CDMP等。苗春雷[22]等應用軟骨細胞和BMSCs以8∶2的比例混合接種在PGA支架上體外共培養，能誘導BMSCs分化為成熟的軟骨細胞并形成軟骨組織，組織學顯示有較連續的成熟軟骨形成，有大量成熟的軟骨陷窩，免疫組化證實有II型膠原分泌。而對照組應用單純相同數量BMSCs在體外僅形成纖維樣組織，單獨應用相同數量的少量軟骨細胞與同體積生物材料混合接種培養，也只能形成極少量的不連續的軟骨組織，明顯少于共培養組，說明去除軟骨細胞的誘導作用后，BMSCs不能單獨在體外形成成熟的軟骨組織，而且軟骨細胞量太少時，也只能形成極少量的軟骨組織。從這實驗結果可以推測在體外共培養過程中，由于BMSCs與軟骨細胞的充分接觸，軟骨細胞分泌多種誘導因子如TGF-β1、IGF及CDMP等有可能以旁分泌方式作用于BMSCs，誘導其向軟骨細胞表型分化，同時BMSCs也暴露于軟骨細胞分泌的特異性細胞外基質如Ⅱ型膠原。軟骨特異性細胞外基質和軟骨細胞膜表面分子也可能在誘導大量BMSCs向軟骨細胞分化并在體外形成軟骨起重要作用，說明軟骨細胞是一個良好的誘導因素，能有效地誘導BMSCs向軟骨細胞分化。

1.2 體內誘導：體內誘導包括體內軟骨微環境誘導和基因轉染誘導。

1.2.1 體內軟骨微環境誘導：關節軟骨再生主要靠缺損周圍軟骨細胞分泌或關節滑液中含有的多種因子，使遷移到缺損處的間充質干細胞，在局部合適的軟骨微環境中，再加上關節活動時的力學刺激，被誘導為軟骨細胞并修復軟骨缺損。董啟榕[23]等將兔BMSCs細胞體外增殖后與II型膠原凝膠混勻，植入到兔股骨滑車關節面上軟骨缺損處，直徑3mm、深度3mm達骨髓腔；對照組為單純Ⅱ型膠原凝膠，4周后實驗組缺損處可見透明軟骨樣組織充填，l2周后缺損處軟骨及軟骨下骨大部分得到修復，邊界清楚，表面稍不平整。而對照組缺損主要為纖維樣軟骨修復為主，這說明BMSCs和II型膠原凝膠的復合物，在關節軟骨原位修復時，即使沒有體外誘導的過程，在關節微環境誘導誘導條件下，也能部分修復關節軟骨。

1.2.2 基因轉染誘導培養：近年還發現BMSCs不僅具有多向分化潛能，還易于外源基因的轉染并能穩定表達外源基因，因此利用基因工程方法將主要誘導因子基因轉入BMSCs，使外源基因在一定時期內能高效表達，植入體內后能通過自分泌或旁分泌途徑來表達目的誘導因子，進一步促進其分化和維持表型穩定，從而彌補由于突然失去體外誘導培養液中的高濃度誘導因子的誘導作用而發生“反分化”。鄭啟新[24]等應用真核表達載體pcDNA3，1-TGF-β1轉染BMSCs，可使BMSCs有效表達活性TGF-β1達3周；在此研究的基礎上，郭曉東[25]等進一步用真核表達載體pcDNA3，1-TGF-β1轉染的BMSCs作為種子細胞，體外培養后接種到多聚賴氨酸包埋的聚DL乳酸可降解多孔材料(PDLLA)，修復同種異體兔關節軟骨缺損，修復后24周，實驗組新生透明樣軟骨表面平整，軟骨下骨再生，與鄰近新骨、軟骨結合緊密，新生組織周圍僅有少量的中性粒細胞浸潤。說明轉基因的BMSCs植入體內后，可能使BMSCs的hTGF-β1自分泌、旁分泌功能顯著加強，通過在缺損處局部形成有效hTGF-β1的濃度，表層的BMSCs在關節腔內低氧壓力以及關節應力的環境下，向軟骨分化。付勤[26]等應用TGF-p。和IGF-l基因轉染大鼠BMSCs后大鼠BMSCs原代細胞接種24 h后可見少量貼壁突起細胞，4、5 天開始形成典型的BMSCs簇狀增生9、10天細胞生長即可達80％～90％融合；傳代后細胞形態較均一免疫熒光法檢測BMSCs的CD29、CD44呈陽性反應，CD34、CD45呈陰性反應。TGF-β1和IGF1基因共同轉染BMSCs修復軟骨缺損是一個較有前景的發展方向，對組織工程軟骨應用于臨床具有重要意義。

2BMSCs應用于軟骨組織工程中存在的幾個問題

2.1 BMSCs構建的軟骨組織工程化組織較正常軟骨形態、生物力學性能存在差異：Wakitani等1994年首先報道了用體外純化培養的自體骨髓MSCs摻入I型膠原凝膠修復兔膝關節軟骨大的全厚缺損，術后2周即形成透明軟骨，24周缺損的關節軟骨和軟骨下骨得以修復，但修復的軟骨比正常關節軟骨薄，有些區域缺乏軟骨蛋白多糖著色。與周圍軟骨融合仍不完全．力學測試結果低于正常軟骨，而采用來源于骨膜BMSCs的效果更差。 1996年Miriam等以高密度培養誘導軟骨細胞表型后，將BMSCs摻入2%的高分子量透明質酸進行自體移植修復羊膝關節軟骨缺損，3個月后形成了組織結構與正常關節軟骨相似的透明軟骨。但形態結構仍有差別，其最終的轉歸還需更長時間的觀察?？梢?，雖然骨髓間充質干細胞體外誘導性培養和體內關節軟骨的修復均能有效地生成軟骨，但只能達到組織形態及生化成分上類似，不能實現與原有軟骨相同的再生。因此目前尚無組織工程學方法能高質量地修復軟骨缺損并獲得很好的遠期療效，要成功產生關節軟骨還需進一步模擬骨髓間充質干細胞向生理狀態下軟骨分化的調控。

2.2 如何調控BMSCs定向分化成軟骨細胞，使其分化的初級軟骨細胞分化為成熟軟骨細胞，并抑制其向肥大軟骨細胞分化，這也是目前軟骨組織工程學中的重要問題。這需要更深入的研究了解BMSCs分化機制。從而指導調控。

2.3 適合于BMSCs的組織工程基質材料同樣是目前研究的難點：理想的軟骨組織工程基質材料應具備以下特點：①良好的生物相容性：其本身或降解產物對種子細胞和機體無毒性，不會引起炎癥和免疫排斥反應；②良好的生物降解性：降解速度需和組織再生速度相匹配，最后可完全吸收；③ 具有三維多孔立體結構。④可加工性和有一定的機械強度；⑤良好的材料－細胞界面；⑥良好的消毒性能[27]。常用的軟骨組織工程基質材料按其來源可分為人工合成和天然材料二大類。合成材料主要有：聚羥乙酸(PGA)、聚乳酸(PLLA、PDLLA)、聚乳酸/聚羥乙酸共聚物(PL－GA)、透明質酸(HA)、藻酸鈣凝膠、聚氧乙烯水凝膠、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(Pluronic)、聚丙烯延胡索酸鹽(PPF)、聚酐、聚磷酸酯等。天然材料有膠原(I或Ⅱ型)、纖維蛋白凝膠、硫酸軟骨素、脫鈣骨基質(DBM)、明膠等[27-28]。這些基質材料各有其優缺點。其中PLGA、HA、Pluronie、PGA/PLLA、PDLLA等在軟骨組織工程研究中顯示了良好的性能而被廣泛接受。

2.4 BMSCs作為軟骨組織工程種子細胞存在的醫學倫理問題：從患者骨髓穿刺獲取骨髓問充質干細胞，經體外誘導分化為軟骨細胞，用于修復軟骨缺損等，與多次切取自體軟骨組織移植相比，患者更愿意接受。間充質干細胞由于是自體細胞經過體外擴增誘導后重新回植，所以病人更容易在心理上接受，涉及的倫理道德問題也較少，因此已成為組織工程軟骨組織種子細胞的主要來源[29]。

3BMSCs在軟骨組織工程化組織構建中的應用前景

正是由于BMSCs具有良好的多組織分化潛能和高增殖活性，獲取方法簡便易行。便于自體移植．故在組織工程領域展現了其良好的應用前景。但就軟骨組織工程而言。有關BMSCs在很多方面還需要進一步研究。一些基本的問題需要給以準確的回答。例如．BMSCs經體外大量擴增后如何能很好地保持多能干細胞的生物學特性；BMSCs分化為軟骨組織，是軟骨內成骨的中間過程還是終極分化；BMSCs的軟骨細胞表型分化和維持的關鍵外部刺激信號和信號傳導途徑等等 隨著BMSCs各方面研究的不斷深入。相信在不久的將來它很可能成為組織損傷修復的有力工具。

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[收稿日期]2008-11-10[修回日期]2009-01-08

編輯/張惠娟