長期體外培養對人臍血間充質干細胞成骨分化潛能的影響

劉廣鵬 張文杰 李宇琳 孫 劍 周 恒 崔 磊

長期體外培養對人臍血間充質干細胞成骨分化潛能的影響

劉廣鵬 張文杰 李宇琳 孫 劍 周 恒 崔 磊

目的觀察體外長期培養對人臍血間充質干細胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）成骨分化潛能的影響，探討其作為組織工程骨種子細胞的可行性。方法流式細胞技術觀察長期體外培養的UCB-MSCs細胞表面抗原表達的變化規律，并通過Alizarin Red染色及堿性磷酸酶活性、骨鈣蛋白含量和鈣離子含量的檢測觀察長期體外培養對UCB-MSCs成骨特性的影響。結果體外長期傳代培養的UCB-MSCs能夠高表達間充質干細胞表面標志物，7代之前的細胞體外增殖能力不隨傳代次數而發生明顯變化。Alizarin Red染色及堿性磷酸酶活性、骨鈣蛋白含量和鈣離子含量的檢測顯示8代之前的UCB-MSCs仍能保持較強的成骨分化能力。結論7代之前的UCB-MSCs能保持穩定的體外成骨分化特性，有望成為較理想的組織工程骨種子細胞。

人臍血間充質干細胞組織工程成骨分化體外培養

骨髓基質干細胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）一直是成體干細胞研究的熱點。BMSCs通過細胞信號通路，分泌造血細胞生長因子等方式對造血干細胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）的增殖分化具有支持、營養作用，同時具有在特定條件下快速增殖、定向分化等干細胞特性[1-2]。近年來的研究發現，在臍帶血（Umbilical cord blood,UCB）中也存在類似的間充質干細胞（UCB derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）。與BMSCs相比，UCB-MSCs來源更豐富，取材更方便，蘊藏著巨大的臨床應用價值[3-4]。本研究將對人UCB-MSCs長期體外培養過程中細胞表面標志、增殖與成骨分化潛能等特性進行闡述，研究其作為組織工程骨種子細胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 UCB-MSCs的分離與培養

5份臍血標本均來源于上海第六人民醫院產科，獲得產婦同意。以等量的PBS緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細胞分離液(Ficoll，美國Sigma公司)，600 g離心20 min。抽取白膜層細胞，以等量的PBS緩沖液洗滌離心，基礎培養液（含低糖DMEM，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺）重懸，接種至100 mm培養皿，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱內培養。第5天首次全量換液，之后每周2次換液，2周后達60%～80%融合時，0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化傳代。

1.2 UCB-MSCs細胞表面抗原分析

分別取第1、4、7、10代細胞，胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。含2%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗細胞，室溫下分別與CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD105-PE及CD166-FITC單克隆抗體避光孵育15 min。PBS緩沖液沖洗細胞，離心，棄上清。加入含1%多聚甲醛的PBS緩沖液0.2 mL，使用同型對照單克隆抗體確定背景標記，流式細胞儀（Beckman Coulter）分析標記細胞。

1.3 UCB-MSCs體外增殖能力檢測

分別取第1、4、7、10代細胞，胰蛋白酶消化，接種24孔板，每孔1×103個細胞。細胞計數儀連續計數10 d，每天計數3孔，繪制生長曲線，計算細胞倍增時間。

1.4 UCB-MSCs成骨分化能力檢測

分別取第1、4、7、10代細胞，胰蛋白酶消化，接種6孔板，每孔1×105個細胞。細胞接種次日起改用成骨條件培養液進行成骨誘導。誘導液配方：基礎培養液，10～8 M地塞米松，10 mM β-磷酸甘油酸鈉，50 μg/L磷酸抗壞血酸。誘導2周后行Alizarin Red染色[5]，觀察細胞外基質鈣化和鈣結節形成情況，并測定鈣離子含量。以未誘導組細胞作為對照。

細胞成骨誘導2周時，同時行堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性和骨鈣蛋白（Osteocalcin，OCN）含量測定，觀察細胞成骨分化狀況。采用磷酸對硝基苯酯二鈉鹽（美國Sigma公司）比色法測定細胞內ALP活性，OCN放免試劑盒（美國Biomedical Technologies公司）檢測OCN含量，實驗方法參照試劑盒說明操作。以未誘導組細胞作為對照。

1.5 統計學處理

應用SAS 6.12統計學軟件進行處理，采用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗，結果以均數±標準差表示，P＜0.05認為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

原代細胞接種5 d后首次換液，細胞呈圓形或短梭形（圖1A）。9 d后細胞進入增殖期，形成細胞集落，細胞形態也逐漸向長梭形改變（圖1B）。2周后基本達到70%融合狀態，傳代培養。傳代后細胞分布均勻，呈成纖維樣細胞形態，4～5 d后可達80%融合。

圖1 原代培養的UCB-MSCs形態學觀察（A：第5天；B：第9天）

2.2 細胞表面抗原分析

不同代次UCB-MSCs表面抗原檢測結果見表1。第1～10代細胞的CD29、CD105和CD166均呈較高表達，陽性率在50%～60%左右。CD31、CD34和CD45則呈低表達，陽性率不超過5%。

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的陽性表達率（%）（n=5）

2.3 細胞倍增時間分析

細胞傳代培養的潛伏期約為36～48 h，第2～3天開始，數量逐漸增多，對數增殖期約為5～7 d，隨后進入增殖平臺期。根據生長曲線可知，UCB-MSCs的群體倍增時間為（36.5±5.52）h。從第7代開始細胞倍增時間逐漸延長達（45.6±4.28）h，差異有顯著性意義（P＜0.05）。

2.4 細胞成骨分化能力檢測

UCB-MSCs成骨誘導2周后，Alizarin Red染色為陽性，形成面積大小不等的紅色鈣鹽沉積區域。對照組則始終無明顯鈣沉積。細胞傳代至第10代時，成骨誘導組仍有鈣鹽沉積形成，但與之前代次細胞相比，成骨能力明顯下降（圖2）。

鈣離子定量（圖3）、ALP活性（圖4）和OCN含量（圖5）的檢測結果則表明，與未誘導組相比，UCB-MSCs傳至第7代時仍保持較強的成骨分化能力。其中第7代細胞的ALP活性和OCN含量開始下降，第10代細胞的鈣離子含量則明顯降低，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 UCB-MSCs成骨誘導2周后Alizarin Red染色

圖3 鈣離子定量檢測

圖4 堿性磷酸酶活性檢測

圖5 骨鈣蛋白含量檢測

3 討論

與骨髓（Bone marrow,BM）含有HSCs一樣，人臍帶血（Umbilical cord blood,UCB）中也含有數量較為豐富的HSCs。并且臍帶血免疫原性相對較弱，其淋巴細胞相對不成熟，可用于人類白細胞抗原（HLA）配型不符者之間的輸注[6-8]。因此，UCB用于治療造血系統疾病已有10余年歷史，國內一些城市也建立了相應的UCB庫。BMSCs通過細胞信號通路，分泌造血細胞生長因子等方式對HSCs的增殖分化具有支持、營養作用，同時還具有在特定條件下快速增殖、定向分化等干細胞特性。近年來研究發現，在UCB中也存在類似的MSCs。這類細胞不表達造血系標志（CD34、CD45、vWF等），而與BMSCs具有類似的生物學行為（貼壁生長、成纖維細胞形態）和細胞表面標志（CD105、CD166、SH2、SH3等）[2-4]。

本實驗中，我們選擇了常用的鑒定間充質來源的細胞表面標記物CD29、CD105和CD166，發現這些表面抗原在UCB-MSCs中呈較高表達，而低表達造血系細胞的表面抗原，如CD31、CD34和CD45。并且體外長期傳代培養未影響細胞表面抗原的表達，與BMSCs比較相似，表明密度梯度離心和貼壁培養的方法可以獲得臍血來源的MSCs。而對傳代細胞倍增時間的分析結果顯示，隨傳代次數增多，7代之內的細胞群體倍增時間變化不明顯，7代之后則逐漸延長，差異有顯著性。

MSCs表達、合成成骨特異性蛋白及細胞外鈣鹽沉積，是檢測MSCs向成骨細胞定向分化的標志物。作為骨組織重要的基質蛋白，ALP活性的高表達是成骨細胞成熟的重要標志，而OCN主要沉積在骨組織的細胞外基質，被認為是成骨細胞特征性的蛋白質[9-10]。本實驗檢測到7代之前的UCB-MSCs成骨誘導后能夠高表達ALP和OCN，而第10代的鈣離子含量則顯著降低。結合抗原分析與細胞倍增時間的結果，表明7代之前的UCB-MSCs具有較高的成骨分化能力和體外增殖能力。體內回植的方法是評價MSCs成骨潛能的最有價值的標準[11]。因此，UCB-MSCs是否能夠作為組織工程骨的種子細胞，還需要進一步開展體內回植的相關研究。

本實驗證實，UCB-MSCs為間充質來源的干細胞，生物學性能穩定，較長期（7代之內）體外傳代培養仍能保持成骨分化能力，有望在組織工程及再生醫學領域獲得進一步的應用。

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The Effects of Long-term Culture In Vitro on the Osteogenic Differentiation Potential of Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells

LIU Guangpeng1,ZHANG Wenjie2,LI Yulin1,SUN Jian1,ZHOU Heng1,CUI Lei12.
1 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.2 Tissue Engineering Key Laboratory,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.

ObjectiveTo observe the effects of long-term culture in vitro on the osteogenic differentiation potential of human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells(UCB-MSCs).MethodsThe CD markers of UCB-MSCs were identified by flow cytometric analysis.Osteogenic differentiation of UCB-MSCs at different passages was evaluated by Alizarin Red staining,and measurement of alkaline phosphatase activity,osteocalcin content,and calcium content respectively.ResultsThe CD marker expression of UCB-MSCs maintained high until passage 10,while the osteogenic differentiation potential of UCB-MSCs began to decrease from passage 7.ConclusionUCB-MSCs(before passage 7)may serve as optimal seed cells for tissue engineered bone.

Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells;Tissue engineering;Osteogenic differentiation; Long-term culture in vitro

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－01－0004－03

2008年11月13日；

2009年1月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.002

國家自然科學基金（30800232）；上海市科技啟明星計劃項目（07QA14053）；上海－英格蘭東北地區科技合作計劃（075407072）。

200235上海市上海組織工研究與開發中心（劉廣鵬，李宇琳，孫劍，周恒，崔磊）。200011上海市上海交通大學附屬第九人民醫院組織工程實驗室（張文杰，崔磊）。