山茱萸炮制增效活性部位對老年小鼠骨髓細胞ＭＮ影響的研究

王明艷　江勵華　趙鳳鳴　李　育　蔡寶昌

摘 要:目的:探討山茱萸炮制增效活性部位對老年小鼠骨髓細胞微核(MN)的影響。方法:取青年組、老年組、用藥組(山茱萸制品幾種溶劑萃取部位)小鼠的骨髓細胞,檢測MN,統計微核率。結果:老年組與青年組相比,微核率差異顯著,而兩個用藥組分別用石油醚萃取部位、水煎液灌胃,小鼠骨髓細胞微核率與老年組相比差異顯著,表現出一定的藥效。結論:山茱萸制品水煎液及山茱萸制品石油醚萃取部位對老年小鼠骨髓細胞DNA有一定的保護作用。

關鍵詞:山茱萸;老年小鼠;骨髓;MN

中圖分類號:R283.1文獻標識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0007-02

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉。其味酸、澀,微溫,歸肝腎經,臨床常用的飲片有山萸肉、酒山萸肉。山茱萸酒蒸后化學成分發生了變化,藥性和臨床療效也發生了很大的變化,其中補益肝腎作用明顯增強。

本課題組完成了“十五”國家科技攻關計劃“山茱萸炮制機理研究”,篩選出了山茱萸炮制增效活性部位(石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位、醇沉多糖部位等)、活性成分(5-羥甲基糠醛、維生素E等),在此基礎上,根據中醫補肝腎理論和現代抗衰老理論,對山茱萸炮制增效活性部位及其成分進行進一步抗衰老研究,本實驗觀察山茱萸炮制增效活性部位對老年小鼠骨髓細胞MN的影響,初步探討山茱萸炮制增效活性部位延緩老年小鼠衰老的作用,為臨床研究提供微觀實驗依據,同時為進一步開發利用山茱萸這一名貴中藥奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材

山茱萸生品購自河南省西峽縣,經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zucc.)的干燥成熟果肉,其炮制品由南京中藥飲片廠依據藥典2000版炮制。

1.2 實驗動物

老齡ICR小鼠,15月齡,40～50g;青年小鼠,3月齡,18～22g,由南京醫科大學實驗動物中心提供,許可證:SCXK(蘇2002-0031)。

2 實驗方法

2.1 山茱萸溶劑萃取部位的制備

取一定量的山茱萸酒蒸品,用10倍量95%乙醇回流提取1.5h,趁熱抽濾,藥渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h,趁熱抽濾,藥渣加10倍量蒸餾水回流提取1.5h,趁熱抽濾,合并濾液,60℃旋轉蒸發濃縮制成浸膏,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取物進行回旋濃縮,其中石油醚、正丁醇溶劑萃取部位用吐溫-80∶植物油∶水=1∶1∶8配成乳劑在本實驗中備用。

取一定量山茱萸酒蒸品粗粉(過20目篩,去核),加蒸餾水提取1.5h,抽濾,濾液加無水乙醇至醇濃度為80%(V∕V),醇沉,過夜,抽濾,然后收集醇沉粗多糖部位,于50℃真空干燥至恒重,精密稱定多糖的重量,用蒸餾水配成一定濃度的溶液備用。

取一定量山茱萸酒蒸品加適量水浸泡2h,加熱煮沸30min,濾出頭煎,藥渣加水適量,煮沸30min,濾出2煎,將2次濾液合并,加熱濃縮至一定體積備用。

2.2 分組與給藥

取青年小鼠12只,作為青年對照組;11月齡老齡小鼠60只,常規飼養至15月齡,隨機分為5組,分別為老年組和4個用藥組,均行灌胃給藥,1次/d,連續30d,給藥劑量根據前期實驗結果選擇、確定,如表1所示。

2.3 MN檢測

小鼠骨髓細胞微核(MN)實驗:頸椎脫臼處死小鼠,取骨髓細胞置生理鹽水中,離心,去上清液;加37℃預溫的0.4%KCl 3mL,置37℃下8min,離心,去上清液;加固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1mL預固定,1000轉/min條件下離心8min,去上清液;再加固定液4mL混勻,固定兩次后氣干法滴片,Giemsa(1∶10,pH6.4)染色8min。每個標本觀察1000個細胞,每組共觀察5000個細胞,計算出微核率,并進行統計學處理。

3 實驗結果與討論

小鼠骨髓細胞微核(MN)實驗結果見表2。

由表2可見:每組觀察5000個細胞,老年組與青年組相比,微核率明顯升高,4個用藥組與老年組相比,石油醚萃取部位和水煎液組微核率顯著下降,P<0.05,反映了藥物的保護作用。其它藥物組差異不明顯。

微核(Micronucleus)檢測是檢測誘變劑和抗變劑靈敏而且可靠的細胞整體檢測方法。細胞受化學誘變劑作用后,

染色體受損傷而發生斷裂,喪失著絲點的染色體斷片或染色單體斷片在細胞有絲分裂后期,遺落在細胞質中,末期后單獨形成1個至幾個小核,即微核。微核的形成反映了染色體受損情況。

遺傳程序說和錯誤積累學認為:老化是DNA分子損傷、未得以修復或錯誤積累的直接后果。許多學者證實:DNA損傷或DNA損傷修復能力的減弱將加速衰老的進程。提高機體抗DNA損傷或提高其對DNA損傷修復的能力將延緩衰老。

本研究結果表明:老年組小鼠微核率較青年組高,反映了DNA的損傷情況,石油醚萃取部位和水煎液組情況有所改善。前期其它實驗表明:山茱萸石油醚萃取部位和山茱萸水煎液有延緩衰老作用。本實驗提示:其抗衰老作用可能與提高機體抗DNA損傷或提高對DNA損傷修復的能力有關。本研究為進一步深入開展山茱萸活性成分抗衰老研究提供了線索。

參考文獻:

[1] 王明艷,蔡寶昌.山茱萸及其活性成分的藥效研究概述[J].中華中醫藥學刊,2008,26(7):1419-1421.

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(責任編輯:陳涌濤)