常見出血實驗模型的建立方法

樓彩霞　崔　箭

摘 要:通過對近10年來國內(nèi)有關出血實驗模型的文獻資料進行整理與分析,從腦、眼、肺、胃、胰腺和子宮等常見出血部位入手,對出血實驗模型的建立方法進行概述,為止血藥物的實驗室研究提供更多的方法學依據(jù)。

關鍵詞:出血部位;動物模型;建立方法

中圖分類號:R965.2文獻標識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0009-03

出血性疾病是臨床常見病和多發(fā)病。選擇、建立合適的出血實驗模型是研究出血性疾病和止血藥物的重要手段。探索和研究出血模型的建立方法對于止血藥物的篩選和藥效學評價等都具有重要意義。近年來,許多學者將致?lián)p因素和中西醫(yī)病因結合起來,應用各自設計的動物模型對止血藥物及其作用機制進行了大量的實驗研究,其中涉及到腦、眼、肺、胃、胰腺和子宮等常見出血部位。現(xiàn)將不同部位常見出血動物模型建立方法在國內(nèi)的研究進展介紹如下。

1 腦出血模型

建立穩(wěn)定、可重復、貼近人類的腦出血(ICH)模型是實驗及臨床研究的關鍵。目前常用的ICH模型主要有腦內(nèi)注入自體血模型、膠原酶誘導ICH 模型、自發(fā)性ICH 模型和微氣囊植入ICH 模型[1]。實驗動物常選用豬和大鼠,有以下幾點原因:①豬在解剖、組織、生理、營養(yǎng)代謝等方面與人類極為接近,腦容量較嚙齒類動物大20~30倍[2];②大鼠腦血管解剖及生理接近人類。相關實驗資料如生理、生化、藥理、形態(tài)等較多,便于比較研究,大鼠價廉,且易繁殖獲得純種動物,利于實驗結果的一致性[3]。

曾錦旗等[4]用顱內(nèi)直接注血法建立大鼠出血性中風中經(jīng)絡模型以及動脈粥樣硬化性家兔出血性中風中經(jīng)絡模型。結果出血性中風大鼠出現(xiàn)明顯血腫,組織病理學改變與人類出血性中風中經(jīng)絡相似。兔腦出血模型建立在動脈粥樣硬化的基礎上,更接近于臨床。戴如飛等[5]通過立體定向術向大鼠腦內(nèi)注入一定量的自體血建立腦出血模型,成功率高(93.3%),方法簡便,與臨床腦出血相似。研究者認為該模型適合研究腦實質(zhì)出血的自然過程、病理形態(tài)學特點及藥物療效觀察。于海洲等[6]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)家兔在造影后經(jīng)常死亡,或出現(xiàn)昏迷、偏癱、血尿等并發(fā)癥,對實驗結果存在一定的影響。為此改進了以往經(jīng)頸總動脈或股動脈插管至主動脈弓的造影方法,參照臨床應用的經(jīng)肱動脈穿刺逆行椎基底動脈造影方法,采用22號套管針穿刺腋動脈法行基底動脈造影,較好地解決兔模型造影死亡率高的問題。

建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型一般采用兩種方式[7]:一是將自體動脈血直接注入蛛網(wǎng)膜下腔;二是刺破頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段某一部位,使血液自動流入蛛網(wǎng)膜下腔。第一種造模方式有側(cè)腦室插管注血法和經(jīng)額蛛網(wǎng)膜下腔插管注血法等[8,9],但多采用小腦延髓池注射自體動脈血的方法造模。高成等[10]分別采用頸內(nèi)動脈穿刺法(PIC)、枕大池2次注血法(ACM)和交叉前池注血法(APC)建立大鼠SAH 模型。認為這3種方法制成的模型適用于研究SAH 不同病理生理改變的需要。PIC腦水腫重、病死率高,適用于SAH 后腦損害的機制研究;ACM腦血管痙攣的時間特征與人SAH 后血管痙攣接近,適用于血管痙攣的機制研究;APC血液恒定分布于前循環(huán),病死率低,適用于研究SAH 后急性腦血管痙攣的發(fā)病機制。

2 眼出血模型

激光眼內(nèi)造模法是眼科比較常見的建模方法,早在20世紀60年代初視網(wǎng)膜激光光凝開始即有所發(fā)現(xiàn)。20世紀70年代衛(wèi)煊等[11]用白兔、貓、狗、猴等進行紅寶石激光視網(wǎng)膜光凝實驗,發(fā)現(xiàn)過高能量會引起視網(wǎng)膜出血乃至玻璃體出血。李晟等[12]用FD-Nd:YAG 532固體激光建立典型視網(wǎng)膜出血和視網(wǎng)膜前出血模型。研究者認為激光通過裂隙燈適配器發(fā)射,經(jīng)激光角膜接觸鏡能準確聚焦于所需照射部位,定位性好,出血位置便于觀察,是較理想的眼內(nèi)出血模型。

錢秋海等[13,14]用胰蛋白酶建立家兔眼內(nèi)出血模型,眼底鏡觀察糖視清對家兔眼內(nèi)出血的影響。大致方法是:用戊巴比妥鈉麻醉,50 u/0.2mL胰蛋白酶,球后注射,注射后每5min,用眼底鏡觀察1次,觀察有無出血、滲血,并計算出血量。

3 肺出血模型

司徒勛等[15]通過外源性五羥色胺(5-HT)氣管滴入建立新生大鼠肺出血模型,濃度以1×10^-5mol/mL較為適宜。模型制作簡便,重復性好,其中彌漫性肺出血占10 %～15 %。研究者認為肺出血可能為5-HT 氣管滴入后導致急性缺氧,誘導ET-1分泌所致,因為ET-1參與肺動脈高壓形成及增加毛細血管通透性,內(nèi)源性ET-1的升高是導致肺出血的重要原因。

陳克正等[16]用低溫加缺氧建立低溫、缺氧兩種病因引起肺出血的動物模型;李娟等[17]用高分子右旋糖酐靜脈注射建立高血粘滯征引起肺出血的動物模型;吳春英等[18]用腎上腺素皮下注射法,模擬臨床先天性心臟病,超量輸液致嚴重肺血管充血,建立幼齡大鼠肺出血模型;杜悅等[19]用內(nèi)毒素腹腔注射建立感染引起肺出血的動物模型等。

4 胃出血模型

胃損傷、潰瘍是導致胃出血的常見原因。夏勇等[20]認為胃損傷模型中以化學性、物理性損傷較常見。化學性胃損傷模型包括非甾體抗炎藥物引起的胃損傷、氰酸甲苯酯引起的胃損傷、尼古丁引起的胃損傷、幽門螺桿菌(HP) 引起的胃損傷、冰乙酸引起的胃損傷、酒精引起的胃損傷等。物理性胃損傷模型包括缺血再灌注引起胃損傷、槍彈噪聲引起胃損傷、冷拘束引起胃損傷等。王凌娟等[21]認為幽門結扎性潰瘍方法可靠,重復性好,省時;藥物誘發(fā)型潰瘍常選用的藥物如阿司匹林、地塞米松、強的松、消炎痛等,對胃粘膜有刺激作用,可加重胃潰瘍的病情;乙酸性潰瘍方法可靠,重復性好,潰瘍深而大,與人類的慢性胃潰瘍極為相似。

吳潤秋等[22]用消炎痛加乙醇法建立小鼠胃出血模型;用附子、干姜、肉桂、黨參、黃芪、辣椒各100g建立熱盛模型。王曉聆等[23]將雜種犬麻醉后,將內(nèi)窺鏡插入胃腸部,并用活檢組織鉗在胃、腸道內(nèi)造成幾處出血病灶形成一個創(chuàng)傷面,建立胃大出血動物模型。

陳易新等[24]通過對脾不統(tǒng)血證中脾氣虛狀態(tài)與出血因素關系的研究,認為勞倦瀉下同時施加出血因素是比較合理的脾不統(tǒng)血證動物模型的塑造方法。黃雪琪等[25]采用番瀉葉、水蛭輔以建立脾不統(tǒng)血模型。陳艷芬等[26]分別采用無水乙醇或辣椒+乙醇給大鼠灌胃造成胃熱Ⅰ°和胃熱Ⅱ°模型,采用NaOH或冰水+NaOH造成胃寒Ⅰ°和胃寒Ⅱ°模型,并認為建立的寒、熱型胃黏膜損傷病證結合模型從理論和方法學上可行,可用于評價相應中藥和方劑的藥效。武永忠等[27]用硫代乙酰胺誘導大鼠慢性肝損害肝硬變及門脈高壓,繼用饑餓誘導法使大鼠發(fā)生門脈高壓性胃粘膜出血,并觀察到隨著饑餓持續(xù)時間延長,模型鼠出血率及嚴重性分級均明顯增加。劉巨源等[28]用幽門結扎法、水浸應激性法、乙酸燒灼法建立大鼠胃潰瘍模型,用利血平法建立小鼠胃潰瘍模型。

5 胰腺出血模型

急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)實驗動物模型的建立方法主要有[29]:經(jīng)十二指腸或胰尾胰管灌注、十二指腸荷包縫合及胰實質(zhì)內(nèi)注射。其中,經(jīng)十二指腸乳頭或胰尾胰管灌注技術要求條件高,首次插管失敗,造成十二指腸乳頭水腫或胰尾出血水腫,再次插管成功率低。而十二指腸荷包縫合在形成AHNP的過程中,容易導致動物死亡,不利于觀察。

薛建國等[30]對傳統(tǒng)的方法進行了改進,設計了在胰腺被膜下均勻注射50g/L牛磺膽酸鈉制備AHNP模型的方法。據(jù)認為胰腺被膜下均勻注射法,方法簡單,可快速建立AHNP動物模型,是值得推廣并可短期內(nèi)大批復制的可靠模型。

活體胰腺炎(AP)模型包括[31]:乙硫氨酸飲食法、胰管結扎法、蛙皮素注射法、胰管注射法、動脈注射微球法、胰腺均勻注射法、高鈣血癥法、免疫法和電針刺激法等;離體胰腺炎模型包括:游離胰腺灌注法[32,33]和高鈣血癥離體研究方法等[34]。

6 子宮出血模型

王曉東等[35]用米非司酮配伍米索前列醇灌胃致早孕大鼠不全流產(chǎn)建立子宮出血模型。方法:將大鼠♀♂按2∶1 比例合籠,次日晨進行陰道涂片檢查,以發(fā)現(xiàn)有精子為妊娠1天。于第七天分別灌胃米非司酮(8∶00)和米索前列醇(18∶00),同時于陰道內(nèi)置入定量棉球一個(棉球用塑料薄膜包裹半側(cè),以防血液漏出和尿液反流)。次日分別于8∶00 和18∶00將棉球取出,放入塑料袋中密閉冷藏保存,同時置換一個新棉球于陰道內(nèi),觀察陰道出血情況,連續(xù)至第14天,處死動物,觀察子宮病理形態(tài)學變化,將收集的每鼠陰道棉球進行出血量測定。研究者認為該模型可作為藥物終止早孕引起子宮出血防治研究的藥效評價的實用模型。

尤昭玲等[36]選擇月經(jīng)正常的雌性育齡恒河猴,在月經(jīng)第3天,用致病性細菌接種宮腔建立恒河猴子宮內(nèi)膜炎性出血模型。研究者認為此模型對于深入研究子宮內(nèi)膜炎性出血止血、內(nèi)膜崩解、重塑修復的機制及研究其防治措施具有重要意義。

孟憲麗等[37]通過置含銅宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)建立家兔子宮異常出血模型。方法:將家兔麻醉后,固定四肢,去毛清潔皮膚后,打開盆腔,暴露子宮角,在右側(cè)子宮距陰道3.5cm處作一直徑2cm的切口,朝陰道方向插入改造后的IUD,并將其固定在子宮壁上,縫合切口。

7 結語

上述出血動物模型各有特點,研究者可根據(jù)需要,選擇和建立適于出血病因?qū)W、藥效學或形態(tài)學等方面研究的動物模型來觀察和探討出、止血各方面情況。通常可以根據(jù)止血藥物的作用機制、作用時間和與人出血損傷相近程度等因素來考慮選擇適合的出血模型。建議采用兩種以上方法建立模型,從多個角度進行研究,這樣才較全面。

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(責任編輯:陳涌濤)

Some Usual Experimental Model of Hemorrhage

Lou Caixia, Cui Jian*

(Minzu University of China, Research Institution of Chinese Minority Traditional Medicine, Beijing 100081)

Abstract:We analyze reference of experimental model of hemorrhage of the past ten years. Experimental model of hemorrhage are summarized in cases of cerebral, subconjunctival, pulmonary, gastrointestinal, pancreatic, uterine hemorrhage. This paper provides foundation for experimental research of hemostatic.

Key words:position of hemorrhage;animal model;method