氟伐他汀對冠心病患者單核細胞ＡＢＣＡ１表達的影響

李華波

摘 要:目的:以冠心病患者外周血單核細胞為研究對象,觀察氟伐他汀對體外培養的冠心病患者外周血單核細胞三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)表達的影響。方法:于冠脈造影時無菌采集血液標本,肝素抗凝,密度梯度離心法分離患者外周血單核細胞,按作用時間與濃度分組,分別與10.0μmol/L氟伐他汀作用0h、6h、12h、24h,以及0、1.0、10、100μmol/L濃度的氟伐他汀作用24h。提取各組細胞總RNA,逆轉錄多聚酶鏈反應檢測ABCA1 mRNA的表達。結果:與對照組比較,10.0μmol/L氟伐他汀作用于單核細胞6h、12h、24h以及不同濃度的氟伐他汀與單核細胞孵育24h均不能增強單核細胞ABCA1 mRNA (P>0.05)。結論:氟伐他汀不能增強冠心病患者單核細胞ABCA1的表達。

關鍵詞:單核細胞;氟伐他汀;三磷酸腺苷結合盒轉運體A1;動脈粥樣硬化

中圖分類號:R541.1文獻標識碼:A文章編號:1673-2197(2009)06-0012-03

研究表明高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)通過參與膽固醇逆轉運(RCT)發揮抗動脈粥樣硬化作用,與冠心病發病危險呈獨立的負相關[1]。在RCT過程中,HDL及其載脂蛋白介導外周組織過剩的膽固醇轉運至肝臟經膽汁排泄。ABCA1功能缺陷可導致Tangier病(TD)和家族性HDL缺乏癥(FHD),主要表現為血漿HDL濃度顯著降低和早發心血管疾病[2]。目前認為ABCA1的主要作用是將細胞內膽固醇和磷脂轉運至細胞膜外并與載脂蛋白A1結合,形成新生HDL顆粒,啟動RCT過程。由此可見,ABCA1在RCT和HDL生成的起始步驟中起重要作用[3]。他汀類藥物在冠心病的防治中占有重要地位。不僅能通過抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶阻斷羥甲戊酸(MVA)途徑以及增加肝臟LDL受體表達而降低血漿LDL-膽固醇的濃度,還能升高HDL,目前對其升高HDL的機理尚未闡明。為探討他汀類藥物是否能通過ABCA1途徑升高HDL水平,我們檢測了他汀類藥物氟伐他汀對冠心病患者外周血單核細胞ABCA1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淋巴細胞分離液(上海試劑二廠);TRIzol RNA 提取試劑(Invitrogen 公司);逆轉錄—多聚酶鏈反應試劑盒(Promega 公司);高保真PCR擴增試劑盒(上海生物工程公司);羊抗人ABCA1—抗(santa cruz 公司),辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗(武漢博士德公司);氟伐他汀原藥粉(cayman公司)。其它試劑與材料均為進口或國產分析純。ABCA1、GAPDH 引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成。

1.2 病例選擇

選擇經冠脈造影確診為冠心病的病例10例(凡是血管狹窄等于或大于50%為陽性病變)。所有研究對象之間沒有血緣關系,通過問卷訪談收集研究對象的基本資料、家族史、既往史、吸煙和飲酒史等。并行血常規、血糖、血脂、肝腎功能、心電圖等相關檢查。剔除TD以及FHD患者、合并周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者、惡性腫瘤、入院前4周內使用降脂等藥物者。

1.3 單核細胞的分離及培養

于冠脈造影時無菌采集冠心病患者血液標本10mL,肝素抗凝,于4℃冰箱靜置30min。生理鹽水1∶1 稀釋。用尖頭吸管輕輕鋪于比重1. 077 淋巴細胞分離液表面,稀釋血與淋巴細胞分離液體積比為2∶1,形成清晰界面。離心機離心20 min,離心后單個核細胞懸于分層液面,呈白膜狀。用吸管輕輕將單個核細胞吸入另一管內,PBS 清洗2 次(1 500r/ min,5min)。將清洗后的細胞重懸于RPMI1640 培養基。將細胞接種于培養皿中,置于37 ℃、5 %CO₂培養箱培養2 h 后,換液,用37℃預熱的培養基清洗2 次,將未貼壁細胞洗脫,瑞氏染色鑒定貼壁細胞為單核細胞,占85 %以上。將貼壁細胞用細胞刮片輕輕刮下,重懸于RPMI 1640培養基中,調整細胞濃度為1×10⁶/mL,然后將每mL上述細胞懸液接種于24孔培養板中。加入干預因素后于37℃、5%CO₂的培養箱內培養。

1.4 實驗分組

按時間分:氟伐他汀(10μmol/L):0h(對照組)、6h、12h、24h組;

按濃度分:氟伐他汀:0(含0.1%DMSO,對照組)、1.0、10、100 μmol/L組。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應

收集各組細胞,按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。取2μg各組細胞總RNA逆轉錄合成cDNA,再各取2μL逆轉錄產物分別進行PCR循環。ABCA1引物序列:上游5-GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTGACA A-3;下游5-GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A-3。PCR擴增產物長度為177 bp。擴增條件:94°C溫育5min,94°C變性40s,60°C復性30s,72°C延伸30s共32個循環,末次循環72℃,延伸10 min。反應結束后,取反應產物6μL進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳, Alphalmager 3400 Imaging圖象分析系統攝圖,并分析各組目的基因及GAPDH基因恢度值,以二者的比值代表各目的基因的表達水平。

1.6 統計學處理

實驗所得數據采用(±s)表示,統計分析用SPSS10.0軟件,兩組間比較采用方差分析及t 檢驗,P<0.05 為差異有顯著性意義。

2 結果

為了觀察單核細胞與氟伐他汀孵育后ABCA1 mRNA的表達是否有改變,采用RT-PCR半定量分析各組單核細胞ABCA1 mRNA的表達。結果顯示,10μmol/ L氟伐他汀作用于單核細胞6h、12h、24h后與作用前比較,各組細胞ABCA1 mRNA表達無明顯變化(P>0.05);單核細胞與不同濃度氟伐他汀孵育24h后與空白對照組比較, ABCA1 mRNA表達亦無明顯變化(P>0.05)。如圖1、圖2所示。

3 討論

單核/巨噬細胞在動脈粥樣硬化的形成中起關鍵作用。循環血單核細胞是動脈粥樣硬化斑塊部位泡沫巨噬細胞主要來源之一,血液中單核細胞遷入動脈內膜轉變為巨噬細胞,單核/巨噬細胞在血管內膜攝取氧化低密度脂蛋白、吞噬過量脂質以及單核/巨噬細胞內脂質轉運異常等原因導致膽固醇和脂質在單核/巨噬細胞中大量沉積,形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊發生的重要早期事件。

當前,在冠心病的防治中,HDL的作用受到高度重視。HDL對動脈血管壁有直接的保護作用,并參與膽固醇逆轉運而降低荷脂巨噬細胞內膽固醇及磷脂,從而穩定動脈粥樣斑塊,使動脈粥樣硬化病變消退。增強膽固醇的逆轉運,有利于抗動脈粥樣硬化的作用。因此,與HDL代謝相關的基因備受關注。ABCA1基因表達異常能導致細胞內膽固醇沉積,影響HDL的合成與分解,HDL顆粒變小,濃度降低,水平嚴重缺陷,冠心病的危險性增加[4]。

在動脈粥樣硬化血管性疾病的防治方面,他汀類藥物降低主要的不良終點事件(如死亡、心肌梗死和中風等)的療效已超越所有其它的藥物,在臨床上廣泛用于冠心病的防治,具有重要的調脂作用及改善內皮功能、增加纖溶和抗炎癥反應等非調脂作用;不僅能通過抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶阻斷羥甲戊酸(MVA)途徑以及增加肝臟LDL受體表達而降低血漿LDL-膽固醇的濃度,還能升高HDL。目前對其升高HDL的機理尚未闡明,有報道認為可能是通過降低膽固醇酯轉運蛋白的活性,以及促進載脂蛋白A1生成增加所引起。

盡管ABCA1在HDL生成起始步驟中起關鍵作用,但與Hitoshi A等所做的普伐他汀對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達的影響研究結果一致[5],我們的實驗也發現他汀類藥物氟伐他汀對冠心病患者單核細胞ABCA1的表達并沒有促進作用(P>0.05)。其機理可能為:一方面,他汀類藥物抑制HMG-CoA還原酶,使中間產物羥甲戊酸(MVA)及終產物膽固醇的生成減少,而膽固醇及氧化固醇在體內可誘導LXR及ABCA1的表達;另一方面,他汀類藥能激活核激素受體PPAR-α及PPAR-γ的表達,二者的激活能誘導LXR的表達,進而促進ABCA1的表達[6]。他汀類藥對調節ABCA1基因表達的調控基因具有雙重效應,因此,盡管能抑制LXR的表達,但對ABCA1基因的表達并沒有表現出明顯的抑制作用。這說明他汀類藥物升高血漿HDL的機理與ABCA1基因表達沒有明顯的關系,若與能增強ABCA1基因表達的藥物聯合用藥,將有利于更好地調節脂質代謝。

參考文獻:

[1] SACKS FM. The role of high-density lipoprotein(HDL) cholesterol in the prevention and treatment of coronary heart disease: expert group recommendations[J] .AM J cardiol,2002,90(2):139-143.

[2] AINO SP, JUSSI N, MIRIAM LRt, et al. Common ABCA1 variants, HDL levels, and cellular cholesterol efflux in subjects with familial low HDL[J] . Lipid Res, 2007, 48(6): 1409 – 1416.

[3] ORAM JF. HDL apolipoproteins and ABCA1 partners in the removal of excess cellular cholesterol[J]. Arterrioscler Thromb Vasc Biol, 2003,23(5):720-727.

[4] VAN ECK M, SINGARAJA RR, JAMES ER, et al.Macrophage ATP-Binding Cassette Transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low-density lipoprotein receptor knockout mice[J]. Arterrioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(4): 929-934.

[5] HITOSHI A, SHUICHI T, HISASHI Y, et al. Effects of Pravastatin on the Expression of ATP-Binding Cassette transporter A1[J]. JPET, 2004,311(1):420-425

[6] MICHAEL MB, CLAIRE LH, CYNTHIA GS, et al. Selective Up-regulation of LXR-regulated Genes ABCA1, ABCG1, and APOE in Macrophages through Increased Endogenous Synthesis of 24(S),25-Epoxycholesterol[J]. Biol Chem, 2007, 282(8): 5207-5216.

(責任編輯:陳涌濤)

Effects of Fluvastatin on the Expression of ABCA1 in Monocytes of

Patients with Coronary Heart Diseasein Vitro

Li Huabo

(Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Hubei institute for nationalities, Enshi 421001,China)

Abstract:AimThe study was designed to examine the effects of fluvastatin onthe expression of ABCA1 mRNA and protein in monocytes of patients with coronary heart disease in vitro. To evaluate the effect of fluvastatin therapy on antiarteriosclerotic.MethodsMonocytes were isolated by density gradient method from blood ofpatients with coronary heart disease, then divided into different group. Different group monocytesincubated with 10.0μmol/L flivastatin for 0h、6h、12h、24h, or incubated with 0、1.0、10、100 μmol/L flivastatin for 24h, respectived. Total RNA of monocytes were abstracted by TRIzol reagent. The levels of ABCA1 mRNAwere measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). ResultsRT-PCR demonstrated that fluvastatin couldnt increase the expression of ABCA1 mRNA in monocytes at different concentrations and times. (compared with control group:P>0.05). Conclusions Fluvastatin couldnt increase ABCA1 mRNA and protein expression in monocytes.

Key words:Monocytes;Fluvastatin;ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1);Atherosclerosis