眼刺激性體外評價方法研究進展

劉天強　肖　丹

摘要：在中藥滴眼液的研發(fā)中，尋找一種簡單、快速的刺激性評價方法體系非常必要。兔眼刺激試驗(TheDraize test)作為眼部安全評價標(biāo)準(zhǔn)已逾幾十載，缺點較多：評分系統(tǒng)主觀性強、動物外推至人種屬差異大、實驗室間變異性大等。許多實驗室在近20年間相繼提出了新的體外試驗方法，對體外眼刺激性試驗方法進行了綜述。關(guān)鍵詞：Draize眼刺激試驗；刺激性；體外試驗；綜述

中圖分類號：R246.82文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197(2009)05-0130-03

毒理學(xué)一直致力于保證人類免受各種物質(zhì)的傷害，如藥品、化工產(chǎn)品、化妝品及家庭用品等。最易導(dǎo)致偶然接觸傷害的部位一般是眼睛和皮膚。這種由化合物刺激導(dǎo)致的生理反應(yīng)一般稱為刺激性，包括客觀的生理變化(局部紅腫、水腫)和主觀感受(瘙癢、疼痛)。在生產(chǎn)、使用這些物品時，都需要對其刺激性進行評價。時至今日，最可靠的安全性評價方法還依賴于動物試驗。但是當(dāng)今社會，動物福利日益受到重視，兔眼刺激性試驗在倫理、科學(xué)上均受到質(zhì)疑，因此尋找節(jié)約高效的試驗方法推動了眼刺激性試驗評價方法的進展。

1Draize兔眼刺激性試驗簡介

隨著制藥工業(yè)的發(fā)展，特別是一些對眼睛有副作用的藥物的發(fā)現(xiàn)，在20世紀(jì)初形成了眼毒理學(xué)。其主要研究目標(biāo)之一是建立一種能用于評價新物質(zhì)潛在刺激性的方法。

Jonas Friedenwald(1897-1955)提出了采用對眼睛各部位毒性分別進行等級評分的方法評價刺激性的方法體系。在Friedenwald的基礎(chǔ)上，John H.Draize(1900-1992)和他的同事在1944年提出了一種新的評價方法，該方法采用皮膚和兔眼作為試驗對象，描述了如何進行劇烈的、溫和的和長期刺激性的評價。這些方法相繼被其它實驗室用以篩選化合物刺激性，被稱為“Draize試驗”。此后，Draize的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)被FDA采用并用以評價某些物質(zhì)的安全性，在相當(dāng)長的一段時間里被FDA視為當(dāng)時最有價值和最可靠的方法，有金標(biāo)準(zhǔn)(Golden standard)之稱。由于該方法每個步驟都要認(rèn)真審查和觀察，其重復(fù)性、關(guān)聯(lián)性、經(jīng)費及倫理等諸多方面均遭到了科學(xué)界的質(zhì)疑與批評，20世紀(jì)60年代，這種試驗方法更是遭到廣泛的批評。

實驗數(shù)據(jù)變化較大導(dǎo)致試驗重復(fù)性較差，特別是輕微刺激性更為明顯。Draize test結(jié)果重復(fù)性較差主要源于兩個方面。其一，受試動物兔的種屬個體差異難以控制；其二，試驗員在對兔眼的觀察和評分上存在的諸多差異難以控制。雖然可以通過擴大樣本容量和培訓(xùn)試驗員來減少這些誤差，但是重復(fù)性較差的缺點還是難以克服。

相同種屬的動物可以以各種不同的方式對刺激性物質(zhì)進行應(yīng)急，不同的試驗者在相同的試驗中可能得到不同的數(shù)據(jù)。加之兔眼的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和人眼也不盡相同，如：兔眼眼淚產(chǎn)量相對較少，眨眼頻率與人眼不同，眼表面的敏感性較人眼差。Draize test只是從炎癥和毒性兩個方面的表現(xiàn)對刺激性進行評價，難以全面反映刺激性作用。其外部的觀察只能將結(jié)果限制在某幾種特定的變化中，不能夠探知其內(nèi)在的機制。當(dāng)受試物質(zhì)直接接觸外眼時，不僅能造成毒性損傷與炎癥反應(yīng)，還能帶來煩躁、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、結(jié)構(gòu)變化、各種分子的改變以及全身效應(yīng)。而這種眼部刺激性試驗卻難以全面體現(xiàn)這些變化。這種人眼與兔眼的關(guān)聯(lián)性遭到質(zhì)疑也就在所難免。

很多科學(xué)家對Draize test主要根據(jù)兩種思路進行修訂，一種是用盡量少的動物挖掘盡量多的信息，同時保證其與人眼反應(yīng)的較好相關(guān)性。另外一種是避免直接將化合物作用于眼，而是先進行皮膚刺激性試驗。科學(xué)家在Draize test的基礎(chǔ)上研究形成了一種新的可被用作替代Draize test的體內(nèi)研究方法，稱作低容量眼部試驗法(10wvolume eyetest：LVET)，該方法相比Draizetest與人眼具有更好的相關(guān)性，優(yōu)于Draize試驗，被證明是一種可以接受的替代方法。但LVET與Drame test都過高估計了人眼對刺激物的反應(yīng)。

2Draize eye test體外試驗方法概述

為了將試驗給動物帶來的痛苦降到最低程度，人道主義者提出了3R(Replacement，Reduction，Refinement)的理念，提出了多種多樣的體外試驗方法，這些方法運用的技術(shù)越來越先進，檢測的范圍與部位也越來越豐富，現(xiàn)將這些常用的體外試驗方法及其優(yōu)缺點簡述如下。

2.1紅細(xì)胞溶血試驗(Red Blood Cells Test)

用多因素分析方法發(fā)現(xiàn)Draize test的檢測原理大部分可以用蛋白變性和細(xì)胞膜破壞來解釋。由此發(fā)展了基于測定從紅細(xì)胞中漏出的血紅蛋白的量來評價膜損傷的試驗方法——溶血試驗(Hemolysis test)。RBCs試驗用來評價某些受試物引起的細(xì)胞初始反應(yīng)(例如接觸化合物后的角膜渾濁度改變)，這些受試物主要損傷細(xì)胞胞漿膜以及使某些蛋白質(zhì)變性；而非刺激性物質(zhì)則不會造成這樣的反應(yīng)。該方法的假說認(rèn)為這種反應(yīng)與眼部組織的刺激反應(yīng)所產(chǎn)生的初始事件具有一定的相關(guān)性。該方法通過分光光度法測定化學(xué)物作用后的紅細(xì)胞懸液吸光度，計算出溶血率和HC50值(即使50％紅細(xì)胞溶血的受試物的濃度值)用作評價受試物的刺激性指標(biāo)。

RBCs試驗是一種作用機制明確、不需用特殊的儀器和設(shè)備、操作快速簡便、不需無菌處理、費用低廉等優(yōu)點。但該法檢測終端過于單一，難以替代Draize test用于全面評價受試物的刺激性，只能用于粗篩試驗。

2.2血紅蛋白變性試驗(Haemoglobin Denaturation Test)

血紅蛋白變性試驗(Haemoglobin Denaturation test，HD test)是用評價蛋白變性的指標(biāo)RDC50(血紅蛋白變性率為50％的受試物濃度)和1％λmax(1％受試物的最大可吸收波長變化值)來預(yù)測化學(xué)物質(zhì)的眼刺激性的一種試驗方法。這種方法的理論基礎(chǔ)是眼刺激性反應(yīng)是由一系列的蛋白質(zhì)變性所引起的，而血紅蛋白變性時會引起吸光度特性的改變，利用血紅蛋白變性試驗來檢測表面活性劑對血紅蛋白結(jié)構(gòu)活性的量化改變作為評價刺激性的指標(biāo)。最初的方法是通過吸光度值計算血紅蛋白的變性率而建立的。后來發(fā)明者提出了新的方程式用以與Draize分值進行相關(guān)性研究，比如進行l(wèi)og數(shù)值代換等。Hayashi T等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)變性試驗(HD test)與紅細(xì)胞溶血試驗(RBCs test)聯(lián)合試驗結(jié)果與Draize評分的相關(guān)性非常高。在刺激性評價中，應(yīng)適當(dāng)考慮二者結(jié)合進行。該法不需要特別設(shè)備，操作簡單，試驗流程短，可大大縮短粗篩的時間。但血紅蛋白變性試驗不能用于在418 nm有強吸收峰的有色物質(zhì)和超過磷酸鹽緩沖液范圍的強酸，也不能檢測磷酸

鹽變性以外的因素引起的眼刺激性。

2.3基于雞胚尿囊絨膜試驗(Chorioallantoic Membrane-based Assays)

受精雞卵尿囊絨膜試驗(Hen's egg test-ehorioallantoic-membrane，HET-CAM)利用尿囊絨膜(CAM)與結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似的特點，通過以下兩種方法檢測化學(xué)物對CAM的損傷來評價其眼刺激性。顯微鏡觀察法(HET-CAM score)是用解剖顯微鏡觀察經(jīng)化學(xué)物作用后不同時間段CAM血管的損傷情況，以出現(xiàn)溶血(hemolysis)、出血(haemorrhage)和凝血(coagulation)作為指標(biāo)進行評分。臺盼藍染色法(CAM-TB)是通過分光光度計測定經(jīng)化學(xué)物處理后CAM吸收的臺盼藍量來評價CAM的損傷。

用CAM方法評估特定種類化學(xué)品眼刺激性的試驗都顯示較滿意結(jié)果。CAM試驗?zāi)芎芎妙A(yù)測角膜混濁和虹膜炎癥；比較而言，HET-CAM分析表面活性劑類產(chǎn)品的效果較好，CAMVA分析醇類效果較好。運用該種方法每天可以檢測大量受試物，且不需要特殊儀器，有快速、靈敏、簡單和價廉的優(yōu)點。由于使用的是孵育第10天的雞卵，CAM上沒有神經(jīng)支配，避免了對雞胚造成的痛苦并可減少動物的使用量，符合“3R”精神。

2.4離體器官試驗(The Enueleated Eye Test)

離體眼球試驗(The Enucleated Eye Test簡稱EET)是一種非常有價值的眼刺激性評價方法。該方法使用離體眼球，其試驗系統(tǒng)非常接近體內(nèi)試驗，無需活體動物。該試驗通過檢測角膜水腫、混濁及熒光素滯留，并進行組織學(xué)觀察評估受試物的眼刺激性。在這些測定指標(biāo)中，角膜水腫客觀性和區(qū)分不同刺激性物質(zhì)的敏感度都較高，再輔以渾濁度和熒光素滯留量兩指標(biāo)，形成了一種具有相當(dāng)說服力的評價眼刺激性的試驗方法。包括離體兔眼、豬眼、雞眼等試驗?zāi)Ｐ停F(xiàn)在主要作為一種評價各種產(chǎn)品及其成分、個體化合物等是否對眼部具有腐蝕性和嚴(yán)重刺激性的篩選方法。該法也可作為體外聯(lián)合評價試驗的篩選方法之一。

2.5細(xì)胞試驗(Cell Cultrue)

細(xì)胞毒性試驗通過檢測培養(yǎng)細(xì)胞對染料或其代謝產(chǎn)物的攝取、還原、排斥、釋放及炎性介質(zhì)漏出等變化，反映受試物對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及存活力的影響。采用該研究思路，國外建立了多種細(xì)胞模型，采用檢測多種指標(biāo)評價物質(zhì)潛在的刺激性，檢測的指標(biāo)主要包括細(xì)胞增殖、膜完整性和細(xì)胞活性。兔眼角膜上皮細(xì)胞就是較早用于該領(lǐng)域的細(xì)胞模型，主要通過LDH和MTT兩種方法進行檢測評價。O.Doucet等利用人眼角膜細(xì)胞建立三維上皮模型，以細(xì)胞毒性反應(yīng)為終點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與動物試驗結(jié)果具有良好的相關(guān)性。檢測終點也發(fā)展到對一些微觀指標(biāo)的測定，如細(xì)胞因子含量等，例如Debbasch等發(fā)現(xiàn)以IL-8釋放為終點的人類角膜上皮細(xì)胞毒性試驗是一種敏感而可靠的預(yù)測人類輕微眼刺激性產(chǎn)品的方法。

2.6商業(yè)試劑盒

采用兔角膜上皮細(xì)胞毒性試驗作為評價方法而建立的CornePack試劑盒，具有靈敏度高、可應(yīng)用于有色物質(zhì)的估測等優(yōu)點，但是與其它細(xì)胞毒性方法相比，對不溶物質(zhì)檢測，其重現(xiàn)性不好，而且與體內(nèi)試驗的相關(guān)性較差。Gor-don和Bergman采用分光光度計測定合成蛋白質(zhì)基質(zhì)中的渾濁度來估測受試物對眼的刺激性，建立了EYTEX試驗系統(tǒng)。將人的鱗狀上皮細(xì)胞和基質(zhì)纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)在尼龍表面，形成有氣液表面的上皮層原型而建立的SKIN2^TMZK1200試劑盒，其結(jié)構(gòu)類似于眼角膜和結(jié)膜。Kurishita等用此模型驗證了39種化妝品成分的刺激性，發(fā)現(xiàn)相關(guān)性較好(r＝0.71)。

2.7其它

Adriaens.E等使用蛞蝓黏膜刺激性試驗(SlugMucosal Irritation assay SMI)作為篩選眼刺激性的試驗方法，該法通過檢測蛞蝓粘膜表面暴露于受試物以后的蛋白質(zhì)變化和酶的釋放評價刺激性，可以檢測出熱和燒灼感的影響，這是其它體外方法無法實現(xiàn)的。研究表明，該試驗是一種有希望的篩選眼刺激性物質(zhì)的評價方法，但耗時較長，不適合大批量的篩選試驗。

3結(jié)論與展望

現(xiàn)階段提出的一些體外試驗方法雖然在一定程度上能夠反應(yīng)出其對眼部的刺激性，但是每種方法都有其各自的缺點，沒有一種方法能像Draize test一樣具有多功能、多指標(biāo)的試驗結(jié)果，所以幾乎沒有一種方法能夠被官方所認(rèn)可接受用以替代Draize test。

當(dāng)今國際上流行的化學(xué)物眼刺激檢測策略有兩種：多層試驗(TIERED TEST)和同步聯(lián)合試驗(BATTERY TEST)。多層試驗又稱逐步檢測策略，即通過文獻資料、理化性質(zhì)等對化學(xué)物的刺激性預(yù)先估測，然后進行體外試驗即替代試驗，對不能確定刺激效應(yīng)的物質(zhì)才進行少量動物的確定性試驗。同步聯(lián)合試驗根據(jù)刺激作用發(fā)生的機制，采用多種體外試驗相結(jié)合的方式進行聯(lián)合檢測，比如用細(xì)胞毒性試驗、蛋白質(zhì)變性試驗、溶血試驗和三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞毒性試驗等幾個試驗相結(jié)合，共同預(yù)測化合物的眼刺激性。但在對體外方法進行同步聯(lián)合試驗的過程中，需要發(fā)展合適的統(tǒng)計學(xué)方法或建立有效的預(yù)測模型。

目前我國在這方面的研究剛剛開始，與國外差距較大，國內(nèi)已經(jīng)有學(xué)者開始嘗試進行了這方面的實驗研究，但是這種研究的深度與廣度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，我國學(xué)者在這一研究領(lǐng)域的發(fā)展空間十分廣闊。將這一領(lǐng)域的研究成果運用于中藥滴眼液的研發(fā)必將加快這一產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

責(zé)任編輯曾楚華