大豆磷脂中溶血磷脂酰膽堿含量測定方法研究

凌立新　楊仕軍　郎　濤

（1.重慶文理學院 化學與環境科學系，重慶 永川 402160；2.四川省江源天然產物有限公司，

四川 洪雅 620360；3.西藏藏藥集團股份有限公司，四川 成都 610041）お

摘 要：目的：采用HPLC法測定大豆磷脂中有關物質溶血性磷脂酰膽堿的含量。方法：采用C₁₈色譜柱，以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動相，紫外檢測器，進樣量20μL。結果：大豆磷脂中主成分磷脂酰膽堿和溶血性磷脂酰膽堿能很好地分離檢出，LPC線性濃度范圍為2.3625μg/mL～189.0μg/mL；平均回收率98.05%，RDS為0.86%（n=6），溶血性磷脂酰膽堿的最低檢測限為1.0ng，所含其它物質對檢測無干擾。結論：該法準確、靈敏、快捷，可作為大豆磷脂中有關物質溶血性磷脂酰膽堿的測定方法。

關鍵詞：大豆磷脂；溶血性磷脂酰膽堿；HPLC

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0035-02

大豆磷脂主要含有磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、溶血磷脂酰絲氨酸（LPS）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、胞苷二磷酸（CDP）等。在大豆磷脂原料的制備、純化及其注射液的制備、貯藏過程中，均會有部分PC分解產生LPC，LPC具有溶血或溶解細胞膜作用，故對大豆磷酯中LPC含量需進行嚴格控制。目前，對大豆磷脂中雜質LPC含量測定的研究不太多，大多采用TLC和HPLC法。TLC法具有儀器設備簡單價廉等優點，但操作煩瑣。HPLC法雖具有快速、易于自動化等特點，但所用檢測器多采用蒸發光散射檢測器和質譜檢測器，儀器價格昂貴。針對目前企業單位一般的液相配置的情況，為了快速、簡便地測定大豆磷脂中的溶血磷脂酰膽堿，我們選擇紫外檢測器。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

HP1100型高效液相色譜儀；PHS-2C型精密酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；Sartorius211型電子天平；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）。

溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰膽堿（PC）對照品，Sigma公司；大豆磷脂（含磷脂酰膽堿量>90%），實驗室自制；甲醇（色譜試劑）；乙腈（色譜試劑）。

1.2 色譜條件

HypersilC₁₈色譜柱：150mn×4.6mn，流動相：甲醇-乙腈-水（50∶40∶10），柱溫：室溫，流速：1.0mL/min，進樣量：20μL；紫外檢測器；進樣量20μL。

1.3 對照品溶液和樣品溶液的配制

取樣品約25mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得樣品試液。取溶血磷脂酰膽堿對照品約10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即對照品溶液。吸取樣品試液和對照品溶液各20μL進樣，即得。

2 結果

2.1 色譜的定性與分離

以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動相，對大豆磷脂中的磷脂酰膽堿（PC）和溶血磷脂酰膽堿能達到較好的分離。本法理論板數按磷脂酰膽堿計為8562；磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿的分離度為5.76，PC的保留時間為17min，LPC保留時間約為22分鐘。分離的色譜圖見圖1。

2.2 線性范圍

精密稱取溶血磷脂酰膽堿對照品10.50 mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為預試液，分別吸取預試液適量，用甲醇稀釋制成濃度為2.3625μg/mL，9.45μg/mL，23.625μg/mL，47.25μg/mL，94.5μg/mL，189.0μg/mL的溶液，分別定量注入20μL，經HPLC法測得峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度（μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=4256.9X+3193.5，r=0.9999。結果顯示，溶血磷脂酰膽堿在線性范圍2.3625μg/mL～189.0μg/mL內，線性關系良好。

2.3 精密度

精密稱取溶血磷脂酰膽堿對照品9.12mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得對照品溶液，取此液連續進樣5次，按峰面積計算精密度。測得平均峰面積為441169，RSD為0.1%。結果顯示，進樣精密度良好。

2.4 回收率實驗

精密稱取大豆磷脂樣品約12.5mg于50mL量瓶中；再精密稱取溶血磷脂酰膽堿對照品約20.0mg于50mL容量瓶中，制得一定濃度的對照A液，再精密量取對照A液5mL，加入其中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，作為對照回收液，按1.3項進行測定。再按此方法制得5個對照回收液，測定。見表1。

2.5 穩定性考察

取試驗樣品，照1.3項下的方法，制得樣品液，在2~8℃放置，分別于0、2、4、6h進樣檢測，以峰面積的變化考察供試液的穩定性，RSD為0.97%，說明本檢測方法的供試液在6h內穩定。見表2。

2.6 樣品測定

精密吸取3個批號的樣品溶液，另取LPC對照品溶液20μL，調節檢測靈敏度，使主成分峰高為滿量程的10%～15%；再分別取對照品溶液和樣品溶液各20μL進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。結果，按外標法計算出3個批號樣品中LPC占樣品總量的0.56%，0.64%，0.63%。

3 討論

（1）分別取PC和LPC對照品適量，在200nm~400nm范圍進行波長掃描。確定有關物質LPC檢測波長為205nm。此吸收波長短，會造成檢測靈敏度不高，干擾嚴重，同時限制了流動相的選擇。本實驗中，參考相關文獻資料，我們選擇了條件Ⅰ：正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脫）；條件Ⅱ：異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脫）；條件Ⅲ：異丙醇-正己烷-水，為流動相進行測試，結果表明：大豆磷脂主峰能與其它雜質峰有效分開，但雜質溶血磷脂酰膽堿與其它雜質不能達到基線分離。調節酸堿性，對溶血磷脂酰膽堿與相鄰雜質峰的分離度基本無影響。參照文獻［1］中流動相的配比，采用甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）為流動相檢測，主峰保留時間約為17min，溶血磷脂酰膽堿與相鄰雜質峰能達到基線分離。經過本法研究，對大豆磷脂樣品（含PC量大于90%）中LPC含量測定，用本方法的條件測試，重現性較好，能滿足實測要求。

（2）逐級稀釋溶血磷脂酰膽堿對照液，測定溶血磷脂酰膽堿的峰高，同時測定相同條件下的色譜基線噪聲，取基線噪聲的10倍值作為溶血磷脂酰膽堿測定的定量限。本法測出溶血磷脂酰膽堿的定量限為1.0ng。

（3）在本文研究范圍內，HPLC-UV法具有良好的線性關系、分析準確度和分析精密度。該法可方便地檢測大豆磷脂中溶血磷脂酰膽堿的含量。

參考文獻：

［1］ 盧學清，洪筱坤.HPLC法測定熊膽中磷脂類化合物PC、PI和PE的含量［J］.中成藥，1999，21（7）：372-374.

［2］ 劉琳琳，張輝.大豆磷脂的開發與利用［J］.陜西科技大學學報，2004，22（4）：50-53.［3］ 王威，張彤.高效液相色譜_蒸發光散射檢測器法對大豆磷脂原料藥中各種成分的含量測定［J］.首都醫藥，2002（8）：49-50.

［4］ 蔣玲，陳亮.HPLC_ELSD法測定大豆磷脂注射液中有關物質［J］.藥學進展，2007，31（8）：366-369.

（責任編輯：王尚勇）