正交設計優選鉤藤堿的提取工藝

李曉云　葉小利　牛小花　李學剛　王立軍

（1.西南大學 藥學院藥用資源化學研究所，重慶 400715；2.西南大學 生命科學學院,重慶 400716）お

摘 要：目的：優化鉤藤中鉤藤堿的提取工藝。方法：以鉤藤堿得率為檢測指標, 采用L⁹(3⁴)正交試驗, 考察乙醇體積分數、提取時間和提取次數3個影響因素, 采用高效液相色譜法進行鉤藤堿測定。結果：提取次數和乙醇的體積分數對檢測指標均有顯著影響，提取時間影響不顯著。最佳提取工藝條件為90 %乙醇熱回流3 次, 每次3 h。結論：優選得到的工藝穩定、方法可行。

關鍵詞：鉤藤;鉤藤堿;正交設計; 高效液相色譜法

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0049-02

鉤藤為茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）、大葉鉤藤（Uncaria macrophylla Wall.）、毛鉤藤（Uncaria hirsute Havil）、華鉤藤（Uncaria sinensis〔Oliv.〕 Havi.）或無柄果鉤藤（Uncaria sessilifructus Roxb）的干燥帶鉤莖枝^[1]。具有清熱平肝，息風定驚之功能。用于頭痛眩暈，感冒夾驚，驚癇抽搐，妊娠子癇^[1]。其主要有效成分為吲哚類生物堿，具有降血壓、抗心律失常、鎮靜、抗癲癇以及對腦的保護作用^[2-3]。常規制劑中其有效成分的提取主要采用水煮濃縮法和70 %～75 %乙醇提取法^[4]，本實驗以此為基礎，采用乙醇回流提取法提取鉤藤中生物堿的正交試驗優化，對不同工藝總生物堿的提取率進行考察，為鉤藤的綜合利用提供參考依據。

1 儀器與材料

LC-6AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；藥材粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TG16-W微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

鉤藤藥材購買于重慶天圣奇仙藥業有限公司，經作者鑒定為茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）；鉤藤堿對照品(購買于上海融禾醫藥科技發展有限公司，含量>99%)，甲醇為色譜純，水為超純水（經Millopor溶液過濾系統處理），其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計

選用L₉（3⁴）正交表進行正交實驗設計，因素水平安排見表1。

2.2 供試品溶液的制備

稱取干燥至恒重的鉤藤粉末（過40目篩）50 g，精密稱取9份，按1-9進行編號，按照正交實驗要求進行操作。提取后再稱定重量，分別用相應濃度的乙醇溶液補足各編號樣品減失重量，搖勻，靜止，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液作供試品溶液。

2.3 鉤藤堿的測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水=55∶45（含三乙胺0.01moL/L，冰醋酸調pH=7.5）；流速1mL/min；檢測波長：λ=254nm；進樣量20μL；柱溫：30 ℃。

2.3.2 線性關系考察

精密稱取鉤藤堿對照品2 mg，甲醇定容于10 mL容量瓶中，搖勻，得鉤藤堿對照品溶液，備用。精密量取上述對照品溶液50、100、200、400、800 μL，分別用甲醇定容至2mL，配制得系列對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件測定，重復進樣（n=3），20 μL/次。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，做標準曲線，得到回歸方程為：Y=561810X-412990，r=0.9999。結果顯示鉤藤堿在0.10～1.6 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取同一質量濃度對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測得峰面積的RSD為0.95 %。結果表明精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗

取新制備的鉤藤供試品溶液,分別在0、2、4、8、10、12分別進樣20μL。按照鉤藤堿對照品峰面積計算RSD為0.4%。表明供試品溶液中鉤藤堿在12內穩定。

2.3.5 重復性試驗

取新制備的鉤藤供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件測定鉤藤堿的含量,RSD為1.4%,表明重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取已知鉤藤堿（含量0.2232%）的鉤藤藥材供試品10份，每份約5.0g，分別精密稱定；其中9份中每3份按80%、100%、120%水平加相應質量的鉤藤堿，另一份做空白對照，制備供試品溶液，分別測定，計算加樣回收率。結果平均回收率為98.02%，RSD為1.21%。

2.3.7 樣品的測定

取供試品溶液，重復進樣（n=3），按照“2.3.1”項下色譜條件測定鉤藤堿的含量，測定結果按外標法計算。

2.4 試驗結果

色譜圖見圖1，正交設計見表2，方差分析見表3。

方差分析可知，影響鉤藤堿提取的主次因素為C＞B＞A,即乙醇的體積分數＞提取次數＞提取時間。方差分析可知，B因素和C因素為顯著因素，A因素為不顯著因素，即提取次數和體積分數對鉤藤堿的提取有顯著影響。最佳提取工藝為A3B3C3，即體積分數為90%的乙醇，提取時間3h，提取次數3次為最佳工藝。

2.5 驗證試驗

精密稱取3份干燥的鉤藤藥材各20g，按最佳工藝進行平行操作，測得提取物中鉤藤堿的平均含量為0.32%，與預測值接近，說明此方法可行。

3 討論

（1）鉤藤所含的有效成分為吲哚類生物堿，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、苯等有機溶劑，難溶于水，因此采取提取后濃縮至無醇時,加水生成沉淀，除去其中的水溶性雜質。

（2）方差分析表明，提取次數和乙醇的體積分數是影響提取效果的顯著因素，提取時間2h與3h的提取效果差別很小，而且要考慮到鉤藤堿、異鉤藤堿的熱不穩定性^[5，6]，以及結合成本及時間問題。因此在工業生產中，可以選擇90%乙醇，2h，3次的工藝條件。鉤藤生物堿具有多種藥理活性，尤其在降壓方面有著良好的應用前景，該提取方法具有穩定性好、鉤藤堿的得率高、操作簡單、生產成本低等優點，適合于工業生產，為開發鉤藤生物堿提供了參考。

參考文獻：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.2000 版（一部）.北京:化學工業出版社,2005.

［2］ 王群，李江疆．鉤藤堿對心血管系統部分藥理作用研究［J］．寧夏醫學雜志，1998，20(5)：289-291．

［3］ 劉新民，于澍仁．鉤藤的藥理研究和臨床應用進展［J］．基層中藥雜志，1990，4(4)：27-28．

［4］ 孫秀華.幾種藥材提取方法評析［J］.西北藥學雜志,1989,4(4):27.

［5］ 陳思蒔，付春梅，李章萬，等.毛細管電泳法測定鉤藤中的鉤藤堿［J］.華西藥學雜志，2008，23（3）：355-356.

［6］ Tianjin Institute of Medicine．Study of Rhynchoph yJlines Extract and Pharmacist［J］．News of Chinese Herbal Medicine，1974,(4):8.

（責任編輯：陳涌濤）