不同灌洗液及麻醉方法對膀胱大量灌注家兔腦水腫的影響

[摘要] 目的 探討不同灌洗液、不同麻醉對膀胱大量灌注后家兔腦水腫的影響，為預防臨床大量膀胱灌注引起的腦水腫提供理論依據。方法 健康雄性家兔20只，體重(3.5±0.3)kg，隨機分為4組(n=5):A組(腰麻+5%葡萄糖注射液)、B組(腰麻+5%甘露醇注射液)、C組(丙泊酚全麻+5%葡萄糖注射液)、D組(丙泊酚全麻+5%甘露醇注射液)。所有家兔根據不同處理方式制作相應模型。所有家兔均在實驗前后抽取靜脈血查血糖和血清鈉濃度;干-濕重法檢測腦組織的含水量;免疫組化法檢測AQP4表達。結果 A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組(P<0.05);四組灌注后血清鈉濃度都明顯下降(P<0.05)，四組之間血清鈉變化無明顯差異(P>0.05);A 組腦組織含水量和腦組織AQP4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)。結論 在大量膀胱灌注中，使用5%甘露醇注射液灌洗，丙泊酚麻醉可有效的預防滲透性腦水腫的發生。

[關鍵詞] 灌洗液;麻醉;膀胱灌注;腦水腫

[中圖分類號] R364.19[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)36-15-03

Effects of Different Irrigation Solution and Anesthesia Methods on Rabbit Cerebral Edema due to A Large Number of Bladder Perfusion

WANG Songqing1ZHANG Yan2ZHANG Chengming1JI Jiafu1

1.Department of Anaesthesiology，Weifang Medical University，Weifang 261042，China;2.Department of Anaesthesiology，Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Weifang 261042，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of two different kinds of irrigation solution and anesthesia on rabbit brain edema caused by a geat deal of preoparative bladdar perfusion in an attempt to provide a theoretical basis for the prevention of brain edema. Methods Twenty healthy male rabbits weighing(3.5±0.3)kg were randomly divided into 4 groups(n=5): Group A spinal anesthesia +5% glucose，Group B spinal anesthesia +5% mannitol，Group C propofol general anesthesia +5% glucose and Group D propofol general anesthesia +5% mannitol. The corresponding models were prepared in all the rabbits according to different treatment. The venous blood was collected from all the rabbits and blood glucose and serum sodium concentration were detected before and after the test. The brain tissue water content was detected by the dry-wet weight method and aquaporin-4(AQP4) expression by immunohistochemistry. Results The blood sugar level was significantly increased in Groups A and C than that in Groups B and D(P<0.05) and the serum sodium level was significantly deceased after bladder irrigation in all the four groups(P<0.05)， and there was no significant difference in the serum sodium levelchanges among the four groups(P>0.05). The brain tissue water content and AQP4 level were significantly higher in Group A was significantly higher than those of other three groups(P<0.05)，and lower in Group D than those in Groups B and C，with no significant difference between Groups B and C. Conclusion The osmotic brain edema can be availably prevented by anaesthesia of propofol and a great deal of preoparative bladdar irrigation with 5% mannitol.

[Key words] Irrigation solution;Anaesthesia;Bladdar irrigation;Brain edema

膀胱灌注隨著灌洗液不斷吸收，使細胞外液明顯增加，造成稀釋性低鈉血癥，可發生滲透性腦水腫。臨床上可見于TURP手術因大量灌洗液的吸收導致的TURS綜合征。許多研究表明丙泊酚對腦缺血再灌注的保護作用，但是對滲透性腦水腫是否有保護作用有待進一步研究，本實驗擬探討不同灌洗液、不同麻醉對膀胱大量灌注后家兔腦水腫的影響，為預防臨床大量膀胱灌注引起的腦水腫提供理論依據，探討5%甘露醇注射液和丙泊酚是否能有效的預防滲透性腦水腫的發生。

1材料與方法

1.1動物

健康雄性家兔20只(月齡6月)，體重(3.5±0.25)kg，由濰坊醫學院動物中心提供。

1.2主要儀器

腰麻穿刺包由揚州市亞光醫療器械有限公司提供;麻醉監護儀由德恩-歐美達公司提供;OLMPUS光學顯微鏡由日本OLMPUS公司提供;電子分析天平由上海第二天平儀器廠提供。

1.3主要試劑和藥品

布比卡因由上海禾豐制藥有限公司提供;丙泊酚由北京費森尤斯卡比醫藥有限公司提供;5%葡萄糖注射液由青州堯王制藥有限公司提供;5%甘露醇注射液由山東魯制藥有限公司提供;Ⅰ抗采用鼠抗兔Aquaporin4單克隆抗體(1︰150，sigma公司，美國);Ⅱ抗是辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(1︰300，sigma公司，美國);DAB顯色劑由北京中杉生物技術有限公司提供。

1.4動物模型的制備

所有家兔適應性飼養7d后，術前禁食12h，禁飲8h，麻醉成功后取仰臥位固定，行恥骨聯合上膀胱切開置入做好標記的靜脈輸液管用以膀胱壓力的監測，用16G號中心靜脈穿刺留置管作尿管對家兔進行插尿管，插入成功后標記刻度，用同樣方法插入同樣深度的另一根管，兩根尿管分別接60mL注射器。一支注射器灌洗液，用靜脈微量泵恒速(20mL·min-1)持續泵入;另一支注射器用于隨時抽吸家兔尿液，保持膀胱壓力4～6cmH2O。灌注時間為3h，家兔在灌注過程中始終保持適度的膀胱充盈，利于手術視野的清晰。灌注過程采用灌洗液加溫、烤燈保暖等措施，肛溫監測，保持家兔體核溫度在正常范圍之內(38.5～ 39.5℃)。

1.5分組與給藥

根據二因素二水平析因設計，將健康雄性家兔20只，體重(3.5±0.3)kg，隨機分為4組(n=5):A組(腰麻+5%葡萄糖注射液)、B組(腰麻+5%甘露醇注射液)、C組(丙泊酚全麻+5%葡萄糖注射液)、D組(丙泊酚全麻+5%甘露醇注射液)。腰麻液配制為0.75%布比卡因0.75mg/kg加10%葡萄糖共0.5mL;丙泊酚麻醉誘導劑量6mg/Kg，維持劑量24mg/(kg·h)。

1.6研究指標和監測方法

1.6.1血清鈉和血糖濃度的測定所有家兔分別在麻醉前和灌注結束抽耳緣靜脈血2mL，靜置0.5h，用離心機離心后提取血清，放入全自動生化分析儀中檢測血清鈉和血糖的濃度。

1.6.2腦組織含水量的測定[1]所有家兔在灌注結束后注射空氣致死快速斷頭，剔掉顱骨，取出整個腦組織，濾紙吸取腦表面的水，將其小腦和延髓部分切除后再沿矢狀面正中分成左右兩部，右半大腦立即稱重(濕重)后放入80℃電熱恒溫干燥箱24h后，再稱定量(干重)。腦組織含水量按Eliot公式計算:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.3病理學觀察所有家兔左半腦石蠟標本切成厚度為6μm的切片，HE染色，光鏡下觀察腦組織的病理學。

1.6.4AQP4免疫組織化學半定量分析免疫組織化學檢測(SP法)AQP4時，每批次各選取每組一只家兔2張切片，在相同條件下染色，每只家兔共染6張切片(3批次)，取均值作為該家兔的定量值，取每個處理組5只家兔的平均值進行統計學分析，以減少因人工操作和試劑批次不同所帶來的誤差。鏡下觀察，切片中有棕色顆粒的地方認為是蛋白陽性表達，每張切片隨機取5個視野，用醫學圖像數字分析系統測定每個視野的平均光密度值。

1.7統計學分析

所有數據用均數±標準差(χ±s)表示。采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，先進行方差齊性檢驗，組內比較采用配對t檢驗，組間比較用單因素方差分析，當差異有顯著性時，采用SNK-q檢驗進一步比較;P<0.05為有統計學意義。

2結果

經過灌注，四組實驗動物灌注后血清鈉較灌注前有明顯的下降(P<0.05)，而組之間血清鈉變化無明顯差異(P>0.05);A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組(P<0.05)，A組與C組之間的血糖變化無明顯差異(P>0.05)，B組與D組之間也無明顯差異(P>0.05)。見表1。

A組腦組織含水量和腦組織AQP4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)。見表2。

滲透性腦水腫時水腫以白質內更明顯，鏡下見膠質細胞不同程度水腫，而神經元細胞水腫不明顯，血腦屏障完整性無明顯變化(封三圖1)。

正常情況下水通道蛋白4可表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞膜處，低鈉血癥可以導致星形膠質細胞終足上的AQP4大量表達(封三圖2)。使用丙泊酚麻醉、5%甘露醇注射液灌注者可見AQP4表達明顯減少(封三圖3)。

3討論

腦水腫分為血管源性腦水腫、細胞毒性腦水腫、滲透性腦水腫、間質性腦水腫、流體靜水壓性腦水腫。其中滲透性腦水腫是指當低血鈉和水中毒等原因使血漿稀釋時，血漿內水分由于滲透壓的改變而大量進入細胞內，以白質內更為明顯。此時細胞外間隙不擴大，血腦屏障也仍保持完整[2]。臨床TURP過程為了使手術視野清晰必須向膀胱不斷灌注沖洗液，隨著灌洗液的不斷吸收，產生全身性稀釋性低鈉血癥，后者可導致滲透性腦水腫、顱內壓升高甚至危及生命。本研究中，所有家兔經過長時間大量膀胱灌注后都產生低鈉血癥，鏡下見腦白質中的膠質細胞不同程度水腫，而神經元細胞水腫不明顯，血腦屏障完整性無明顯變化，提示動物模型制備成功。

目前國內常用的灌洗液為5%葡萄糖注射液或5%甘露醇注射液。陳娟等[3]對不同膀胱灌洗液在TURP中對患者電解質的影響研究表明，使用5%葡萄糖注射液和5%甘露醇注射液分別灌注后對血鉀、鈣、氯濃度的影響都不大，但是前者可以造成術后血糖的升高，隨著灌洗液不斷吸收，兩者都會產生稀釋性低鈉血癥。影響灌洗液吸收的主要因素包括:灌洗液的灌注壓力、手術時間、切除組織量、被切開靜脈的數量和大小、解剖變異、手術技術等[4]。至于麻醉方式對灌洗液的吸收是否有影響目前尚未研究。本研究中，通過等劑量等時間的灌注，術中保持相同灌注壓，由同一個人操作灌注，以減少誤差。試驗結果顯示四組之間的血清鈉下降幅度無明顯差異，A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組，表明使用腰麻與丙泊酚麻醉對灌注液的吸收無明顯的影響，而用5%葡萄糖注射液灌注術后會引起血糖升高，兩種灌洗液對血清鈉的影響無明顯差異。

AQP4是一種選擇性水通道蛋白，它在腦部的許多結構廣泛存在，高表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的膠質細胞膜處[5]。在不同機制的腦水腫及不同病因引起的腦水腫中，AQP4都起著重要作用。Mahmood Amiry等[6]研究表明，在滲透性腦水腫中血管周圍的星形膠質細胞膜上的AQP4控制著水分進入細胞內，低鈉血癥可以導致血腦屏障中的星形膠質細胞終足上的AQP4大量表達，而不影響內皮細胞及其他部位的AQP4表達。李燕華等[7]通過離體試驗表明低滲液可導致星形膠質細胞水腫和生存能力下，AQP4mRNA和蛋白表達增強，且二者之間存在負相關關系，證實了AQP4的表達與滲透壓直接相關?？梢夾QP4表達的調節對腦內水平衡的維持相當重要，但其調節機制并不十分清楚。AQP4的作用機制與G蛋白有關，而蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是G蛋白信號通路的中心分子之一，PKC是富含絲/蘇氨基酸的蛋白激酶，在細胞信號傳導系統中充當第二信使角色[8]。Han 最早報道活化的PKC可以使AQP4 磷酸化從而抑制AQP4的活性[9]。Zelenina等利用轉染AQP4 的卵母細胞研究也發現PKC可以通過AQP4的磷酸化作用降低細胞對水的滲透性[10]。另外，Gunnarson等[11]研究AQP4的代謝發現，活化的PKC還可分解酪氨酸，減少AQP4蛋白和mRNA的表達，進而影響其功能[12]。丙泊酚能使PKC對肌醇、鈣/磷脂酰絲氨酸等內生激動劑的敏感性明顯增高，因此PKC蛋白參與了異丙酚的麻醉機制。還有Hemmings等[13]發現異丙酚能使純化腦的PKC活性增加，而PKC的活性與IP/Ca-和DG/PKC調節相關。國內學者[14]還發現異丙酚可使犬鼠腦區 NO、cGMP含量降低。丙泊酚對腦缺血再灌注損傷具有保護作用的研究已經很多，但是對滲透性腦水腫是否有保護作用尚未研究。本實驗研究結果顯示，A組腦組織含水量和腦組織Aquaporin4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)，表明丙泊酚和甘露醇在滲透性腦水腫時能引起AQP4表達下調，降低腦水腫的程度，起到腦保護的作用。其機制可能與以下幾方面有關:甘露醇可通過增加水從腦組織到血管內腔的滲透壓而減輕腦水腫，且甘露醇可以通過改善紅細胞流量來增加腦部含氧量，通過減少血管收縮來減低顱內壓[15];陳麗霞等研究發現甘露醇可能通過抑制AQPI、AQP4的表達，減輕腦水腫的嚴重程度，從而起到腦保護作用。但是通過什么途徑調節這些蛋白表達的機制尚不清楚，有待于我們今后進一步研究。丙泊酚可能通過增加PKC活性，后者減少AQP4蛋白和mRNA的表達以及使AQP4磷酸化，導致AQP4的含量和活性下降，減少水分從細胞外到細胞內，達到減輕腦水腫的目的。但是具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，如果麻醉方式用丙泊酚全麻、灌洗液用5%甘露醇注射液對預防大量膀胱灌注后滲透性腦水腫起到一定的肯定作用，還可以減免5%葡萄糖注射液灌注后引起高血糖的潛在風險。

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(收稿日期:2009-09-22)