不同灌洗液及麻醉方法對(duì)膀胱大量灌注家兔腦水腫的影響

[摘要] 目的 探討不同灌洗液、不同麻醉對(duì)膀胱大量灌注后家兔腦水腫的影響，為預(yù)防臨床大量膀胱灌注引起的腦水腫提供理論依據(jù)。方法 健康雄性家兔20只，體重(3.5±0.3)kg，隨機(jī)分為4組(n=5):A組(腰麻+5%葡萄糖注射液)、B組(腰麻+5%甘露醇注射液)、C組(丙泊酚全麻+5%葡萄糖注射液)、D組(丙泊酚全麻+5%甘露醇注射液)。所有家兔根據(jù)不同處理方式制作相應(yīng)模型。所有家兔均在實(shí)驗(yàn)前后抽取靜脈血查血糖和血清鈉濃度;干-濕重法檢測(cè)腦組織的含水量;免疫組化法檢測(cè)AQP4表達(dá)。結(jié)果 A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組(P<0.05);四組灌注后血清鈉濃度都明顯下降(P<0.05)，四組之間血清鈉變化無(wú)明顯差異(P>0.05);A 組腦組織含水量和腦組織AQP4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無(wú)明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)。結(jié)論 在大量膀胱灌注中，使用5%甘露醇注射液灌洗，丙泊酚麻醉可有效的預(yù)防滲透性腦水腫的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 灌洗液;麻醉;膀胱灌注;腦水腫

[中圖分類(lèi)號(hào)] R364.19[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2009)36-15-03

Effects of Different Irrigation Solution and Anesthesia Methods on Rabbit Cerebral Edema due to A Large Number of Bladder Perfusion

WANG Songqing1ZHANG Yan2ZHANG Chengming1JI Jiafu1

1.Department of Anaesthesiology，Weifang Medical University，Weifang 261042，China;2.Department of Anaesthesiology，Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Weifang 261042，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of two different kinds of irrigation solution and anesthesia on rabbit brain edema caused by a geat deal of preoparative bladdar perfusion in an attempt to provide a theoretical basis for the prevention of brain edema. Methods Twenty healthy male rabbits weighing(3.5±0.3)kg were randomly divided into 4 groups(n=5): Group A spinal anesthesia +5% glucose，Group B spinal anesthesia +5% mannitol，Group C propofol general anesthesia +5% glucose and Group D propofol general anesthesia +5% mannitol. The corresponding models were prepared in all the rabbits according to different treatment. The venous blood was collected from all the rabbits and blood glucose and serum sodium concentration were detected before and after the test. The brain tissue water content was detected by the dry-wet weight method and aquaporin-4(AQP4) expression by immunohistochemistry. Results The blood sugar level was significantly increased in Groups A and C than that in Groups B and D(P<0.05) and the serum sodium level was significantly deceased after bladder irrigation in all the four groups(P<0.05)， and there was no significant difference in the serum sodium levelchanges among the four groups(P>0.05). The brain tissue water content and AQP4 level were significantly higher in Group A was significantly higher than those of other three groups(P<0.05)，and lower in Group D than those in Groups B and C，with no significant difference between Groups B and C. Conclusion The osmotic brain edema can be availably prevented by anaesthesia of propofol and a great deal of preoparative bladdar irrigation with 5% mannitol.

[Key words] Irrigation solution;Anaesthesia;Bladdar irrigation;Brain edema

膀胱灌注隨著灌洗液不斷吸收，使細(xì)胞外液明顯增加，造成稀釋性低鈉血癥，可發(fā)生滲透性腦水腫。臨床上可見(jiàn)于TURP手術(shù)因大量灌洗液的吸收導(dǎo)致的TURS綜合征。許多研究表明丙泊酚對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用，但是對(duì)滲透性腦水腫是否有保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)擬探討不同灌洗液、不同麻醉對(duì)膀胱大量灌注后家兔腦水腫的影響，為預(yù)防臨床大量膀胱灌注引起的腦水腫提供理論依據(jù)，探討5%甘露醇注射液和丙泊酚是否能有效的預(yù)防滲透性腦水腫的發(fā)生。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

健康雄性家兔20只(月齡6月)，體重(3.5±0.25)kg，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器

腰麻穿刺包由揚(yáng)州市亞光醫(yī)療器械有限公司提供;麻醉監(jiān)護(hù)儀由德恩-歐美達(dá)公司提供;OLMPUS光學(xué)顯微鏡由日本OLMPUS公司提供;電子分析天平由上海第二天平儀器廠(chǎng)提供。

1.3主要試劑和藥品

布比卡因由上海禾豐制藥有限公司提供;丙泊酚由北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司提供;5%葡萄糖注射液由青州堯王制藥有限公司提供;5%甘露醇注射液由山東魯制藥有限公司提供;Ⅰ抗采用鼠抗兔Aquaporin4單克隆抗體(1︰150，sigma公司，美國(guó));Ⅱ抗是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1︰300，sigma公司，美國(guó));DAB顯色劑由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。

1.4動(dòng)物模型的制備

所有家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，術(shù)前禁食12h，禁飲8h，麻醉成功后取仰臥位固定，行恥骨聯(lián)合上膀胱切開(kāi)置入做好標(biāo)記的靜脈輸液管用以膀胱壓力的監(jiān)測(cè)，用16G號(hào)中心靜脈穿刺留置管作尿管對(duì)家兔進(jìn)行插尿管，插入成功后標(biāo)記刻度，用同樣方法插入同樣深度的另一根管，兩根尿管分別接60mL注射器。一支注射器灌洗液，用靜脈微量泵恒速(20mL·min-1)持續(xù)泵入;另一支注射器用于隨時(shí)抽吸家兔尿液，保持膀胱壓力4～6cmH2O。灌注時(shí)間為3h，家兔在灌注過(guò)程中始終保持適度的膀胱充盈，利于手術(shù)視野的清晰。灌注過(guò)程采用灌洗液加溫、烤燈保暖等措施，肛溫監(jiān)測(cè)，保持家兔體核溫度在正常范圍之內(nèi)(38.5～ 39.5℃)。

1.5分組與給藥

根據(jù)二因素二水平析因設(shè)計(jì)，將健康雄性家兔20只，體重(3.5±0.3)kg，隨機(jī)分為4組(n=5):A組(腰麻+5%葡萄糖注射液)、B組(腰麻+5%甘露醇注射液)、C組(丙泊酚全麻+5%葡萄糖注射液)、D組(丙泊酚全麻+5%甘露醇注射液)。腰麻液配制為0.75%布比卡因0.75mg/kg加10%葡萄糖共0.5mL;丙泊酚麻醉誘導(dǎo)劑量6mg/Kg，維持劑量24mg/(kg·h)。

1.6研究指標(biāo)和監(jiān)測(cè)方法

1.6.1血清鈉和血糖濃度的測(cè)定所有家兔分別在麻醉前和灌注結(jié)束抽耳緣靜脈血2mL，靜置0.5h，用離心機(jī)離心后提取血清，放入全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)血清鈉和血糖的濃度。

1.6.2腦組織含水量的測(cè)定[1]所有家兔在灌注結(jié)束后注射空氣致死快速斷頭，剔掉顱骨，取出整個(gè)腦組織，濾紙吸取腦表面的水，將其小腦和延髓部分切除后再沿矢狀面正中分成左右兩部，右半大腦立即稱(chēng)重(濕重)后放入80℃電熱恒溫干燥箱24h后，再稱(chēng)定量(干重)。腦組織含水量按Eliot公式計(jì)算:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.3病理學(xué)觀(guān)察所有家兔左半腦石蠟標(biāo)本切成厚度為6μm的切片，HE染色，光鏡下觀(guān)察腦組織的病理學(xué)。

1.6.4AQP4免疫組織化學(xué)半定量分析免疫組織化學(xué)檢測(cè)(SP法)AQP4時(shí)，每批次各選取每組一只家兔2張切片，在相同條件下染色，每只家兔共染6張切片(3批次)，取均值作為該家兔的定量值，取每個(gè)處理組5只家兔的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以減少因人工操作和試劑批次不同所帶來(lái)的誤差。鏡下觀(guān)察，切片中有棕色顆粒的地方認(rèn)為是蛋白陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，用醫(yī)學(xué)圖像數(shù)字分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野的平均光密度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，當(dāng)差異有顯著性時(shí)，采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)一步比較;P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

經(jīng)過(guò)灌注，四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌注后血清鈉較灌注前有明顯的下降(P<0.05)，而組之間血清鈉變化無(wú)明顯差異(P>0.05);A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組(P<0.05)，A組與C組之間的血糖變化無(wú)明顯差異(P>0.05)，B組與D組之間也無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

A組腦組織含水量和腦組織AQP4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無(wú)明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

滲透性腦水腫時(shí)水腫以白質(zhì)內(nèi)更明顯，鏡下見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞不同程度水腫，而神經(jīng)元細(xì)胞水腫不明顯，血腦屏障完整性無(wú)明顯變化(封三圖1)。

正常情況下水通道蛋白4可表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞膜處，低鈉血癥可以導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上的AQP4大量表達(dá)(封三圖2)。使用丙泊酚麻醉、5%甘露醇注射液灌注者可見(jiàn)AQP4表達(dá)明顯減少(封三圖3)。

3討論

腦水腫分為血管源性腦水腫、細(xì)胞毒性腦水腫、滲透性腦水腫、間質(zhì)性腦水腫、流體靜水壓性腦水腫。其中滲透性腦水腫是指當(dāng)?shù)脱c和水中毒等原因使血漿稀釋時(shí)，血漿內(nèi)水分由于滲透壓的改變而大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以白質(zhì)內(nèi)更為明顯。此時(shí)細(xì)胞外間隙不擴(kuò)大，血腦屏障也仍保持完整[2]。臨床TURP過(guò)程為了使手術(shù)視野清晰必須向膀胱不斷灌注沖洗液，隨著灌洗液的不斷吸收，產(chǎn)生全身性稀釋性低鈉血癥，后者可導(dǎo)致滲透性腦水腫、顱內(nèi)壓升高甚至危及生命。本研究中，所有家兔經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間大量膀胱灌注后都產(chǎn)生低鈉血癥，鏡下見(jiàn)腦白質(zhì)中的膠質(zhì)細(xì)胞不同程度水腫，而神經(jīng)元細(xì)胞水腫不明顯，血腦屏障完整性無(wú)明顯變化，提示動(dòng)物模型制備成功。

目前國(guó)內(nèi)常用的灌洗液為5%葡萄糖注射液或5%甘露醇注射液。陳娟等[3]對(duì)不同膀胱灌洗液在TURP中對(duì)患者電解質(zhì)的影響研究表明，使用5%葡萄糖注射液和5%甘露醇注射液分別灌注后對(duì)血鉀、鈣、氯濃度的影響都不大，但是前者可以造成術(shù)后血糖的升高，隨著灌洗液不斷吸收，兩者都會(huì)產(chǎn)生稀釋性低鈉血癥。影響灌洗液吸收的主要因素包括:灌洗液的灌注壓力、手術(shù)時(shí)間、切除組織量、被切開(kāi)靜脈的數(shù)量和大小、解剖變異、手術(shù)技術(shù)等[4]。至于麻醉方式對(duì)灌洗液的吸收是否有影響目前尚未研究。本研究中，通過(guò)等劑量等時(shí)間的灌注，術(shù)中保持相同灌注壓，由同一個(gè)人操作灌注，以減少誤差。試驗(yàn)結(jié)果顯示四組之間的血清鈉下降幅度無(wú)明顯差異，A組與C組灌注后血糖增加明顯高于B組與D組，表明使用腰麻與丙泊酚麻醉對(duì)灌注液的吸收無(wú)明顯的影響，而用5%葡萄糖注射液灌注術(shù)后會(huì)引起血糖升高，兩種灌洗液對(duì)血清鈉的影響無(wú)明顯差異。

AQP4是一種選擇性水通道蛋白，它在腦部的許多結(jié)構(gòu)廣泛存在，高表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的膠質(zhì)細(xì)胞膜處[5]。在不同機(jī)制的腦水腫及不同病因引起的腦水腫中，AQP4都起著重要作用。Mahmood Amiry等[6]研究表明，在滲透性腦水腫中血管周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞膜上的AQP4控制著水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，低鈉血癥可以導(dǎo)致血腦屏障中的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上的AQP4大量表達(dá)，而不影響內(nèi)皮細(xì)胞及其他部位的AQP4表達(dá)。李燕華等[7]通過(guò)離體試驗(yàn)表明低滲液可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫和生存能力下，AQP4mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且二者之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，證實(shí)了AQP4的表達(dá)與滲透壓直接相關(guān)。可見(jiàn)AQP4表達(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)腦內(nèi)水平衡的維持相當(dāng)重要，但其調(diào)節(jié)機(jī)制并不十分清楚。AQP4的作用機(jī)制與G蛋白有關(guān)，而蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是G蛋白信號(hào)通路的中心分子之一，PKC是富含絲/蘇氨基酸的蛋白激酶，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中充當(dāng)?shù)诙攀菇巧玔8]。Han 最早報(bào)道活化的PKC可以使AQP4 磷酸化從而抑制AQP4的活性[9]。Zelenina等利用轉(zhuǎn)染AQP4 的卵母細(xì)胞研究也發(fā)現(xiàn)PKC可以通過(guò)AQP4的磷酸化作用降低細(xì)胞對(duì)水的滲透性[10]。另外，Gunnarson等[11]研究AQP4的代謝發(fā)現(xiàn)，活化的PKC還可分解酪氨酸，減少AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響其功能[12]。丙泊酚能使PKC對(duì)肌醇、鈣/磷脂酰絲氨酸等內(nèi)生激動(dòng)劑的敏感性明顯增高，因此PKC蛋白參與了異丙酚的麻醉機(jī)制。還有Hemmings等[13]發(fā)現(xiàn)異丙酚能使純化腦的PKC活性增加，而PKC的活性與IP/Ca-和DG/PKC調(diào)節(jié)相關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者[14]還發(fā)現(xiàn)異丙酚可使犬鼠腦區(qū) NO、cGMP含量降低。丙泊酚對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用的研究已經(jīng)很多，但是對(duì)滲透性腦水腫是否有保護(hù)作用尚未研究。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，A組腦組織含水量和腦組織Aquaporin4含量明顯高于其他組(P<0.05)，在B、C、D三組之間，B組與C組無(wú)明顯差異(P>0.05)，D組含量低于B組和C組(P<0.05)，表明丙泊酚和甘露醇在滲透性腦水腫時(shí)能引起AQP4表達(dá)下調(diào)，降低腦水腫的程度，起到腦保護(hù)的作用。其機(jī)制可能與以下幾方面有關(guān):甘露醇可通過(guò)增加水從腦組織到血管內(nèi)腔的滲透壓而減輕腦水腫，且甘露醇可以通過(guò)改善紅細(xì)胞流量來(lái)增加腦部含氧量，通過(guò)減少血管收縮來(lái)減低顱內(nèi)壓[15];陳麗霞等研究發(fā)現(xiàn)甘露醇可能通過(guò)抑制AQPI、AQP4的表達(dá)，減輕腦水腫的嚴(yán)重程度，從而起到腦保護(hù)作用。但是通過(guò)什么途徑調(diào)節(jié)這些蛋白表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，有待于我們今后進(jìn)一步研究。丙泊酚可能通過(guò)增加PKC活性，后者減少AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)以及使AQP4磷酸化，導(dǎo)致AQP4的含量和活性下降，減少水分從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到減輕腦水腫的目的。但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，如果麻醉方式用丙泊酚全麻、灌洗液用5%甘露醇注射液對(duì)預(yù)防大量膀胱灌注后滲透性腦水腫起到一定的肯定作用，還可以減免5%葡萄糖注射液灌注后引起高血糖的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

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(收稿日期:2009-09-22)