反膠團(tuán)萃取分離純化色氨酸的研究

摘要:色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一。針對色氨酸的分離純化，提出一種基于反膠團(tuán)法的分離純化方法。結(jié)果表明，采用AOT/異辛烷反膠團(tuán)體系，在AOT濃度60mmol/L;;萃取pH為2.0;離子強(qiáng)度為0.1mol/L;反萃取PH為10;離子強(qiáng)度為1mol/L的條件下，經(jīng)過一次萃取，回收率可以達(dá)到70%左右。

關(guān)鍵詞:色氨酸 反膠團(tuán) AOT 萃取

0 引言

色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一。色氨酸對人和動(dòng)物的生長發(fā)育、新陳代謝起重要的作用，對預(yù)防糙皮病、抑郁癥，改善睡眠和增強(qiáng)自信心有著很重要的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)。反膠團(tuán)是針對于生物活性的氨基酸或蛋白質(zhì)提出的一種液液萃取體系。同傳統(tǒng)氨基酸分離純化手段相比，它具有分離步驟少、易于放大、高選擇性、低成本的特點(diǎn)。從20世紀(jì)70年代末反膠團(tuán)概念的提出到現(xiàn)在，它一直是生化工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在研究利用反膠團(tuán)從實(shí)際復(fù)雜體系(如發(fā)酵液中)分離純化目標(biāo)蛋白時(shí)，如果直接從復(fù)雜體系入手，盲目性很強(qiáng)，很難對萃取過程或出現(xiàn)的問題進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和判斷。而從模擬體系入手，在研究清楚萃取過程的主要規(guī)律后，再進(jìn)行復(fù)雜體系的研究，是一種事半功倍的研究思路。作者通過正交實(shí)驗(yàn)分析方法，研究了反膠團(tuán)體系中AOT濃度、萃取PH、萃取離子強(qiáng)度、反萃PH和反萃離子強(qiáng)度五個(gè)因素對色氨酸萃取的影響，從而推斷出最優(yōu)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉)購自嘉善巨楓化工廠，異辛烷購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，其他試劑購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。水溶液均用去離子水配制，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

1.2 萃取與反萃實(shí)驗(yàn) 將適量的AOT加入到異辛烷溶液中搖勻，使其均勻分布于有機(jī)相，得到澄清透明穩(wěn)定的反膠團(tuán)系統(tǒng)。準(zhǔn)確量取1mL色氨酸儲(chǔ)備液于不同緩沖液中，稀釋，由不同濃度的離子構(gòu)成酸緩沖液，PHPI)的離子強(qiáng)度的緩沖液作為反萃取水相，與前萃取所得的有機(jī)相混合，放在振蕩機(jī)上劇烈搖晃后20min，傾入離心管，進(jìn)行離心。用滴管小心地將兩相分開，下層水相即為純化的色氨酸。

1.3 色氨酸含量分析 利用對二甲氨基苯甲醛法測量水相中色氨酸含量。在752紫外光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)上測定600nm處的吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)濃度-吸收度曲線，以計(jì)算色氨酸的濃度。色氨酸測量范圍為0-100μg/mL。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

反膠團(tuán)體系影響因素很多，需要對各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇色氨酸萃取最佳條件，但是各個(gè)因素太復(fù)雜，如果每個(gè)因素都分開討論，工作量很大，而且需要很長時(shí)間，因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)的方法。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用“正交表”進(jìn)行科學(xué)地安排與分析多因素試驗(yàn)的方法。其主要優(yōu)點(diǎn)是能在很多試驗(yàn)方案中挑選出代表性強(qiáng)的少數(shù)幾個(gè)試驗(yàn)方案，并且通過這少數(shù)試驗(yàn)方案的試驗(yàn)結(jié)果的分析，推斷出最優(yōu)方案，同時(shí)還可以作進(jìn)一步的分析，得到比試驗(yàn)結(jié)果本身給出的還要多的有關(guān)各因素的信息。

在本次實(shí)驗(yàn)中，對AOT濃度、萃取pH、萃取離子強(qiáng)度、反萃pH、反萃離子強(qiáng)度這五個(gè)因素進(jìn)行考慮。

固定以下幾個(gè)條件:

色氨酸儲(chǔ)備液單位為1mg/ml;有機(jī)溶劑為異辛烷;表面活性劑為AOT;無助表面活性劑;萃取和反萃相比為1:1;萃取和反萃離子都為KCL;萃取時(shí)間15min;離心(3500r/min，5min);反萃時(shí)間為20min;離心(3500r/min，5min)，萃取溫度為室溫。實(shí)驗(yàn)的各因素級(jí)水平如(表3-1):

取16個(gè)100mL的三角瓶，并依次編號(hào)，按照所述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，固定條件不變，但是對涉及正交的幾個(gè)因素的種類和加入量按照表3-2進(jìn)行試劑的正確加入，采用正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下:

2.1 PH對萃取過程的影響 水相的PH值決定了色氨酸表面電荷的狀態(tài)，從而對萃取過程造成影響，由于AOT為陰離子表面活性劑，在進(jìn)行萃取過程中應(yīng)該是PH

在進(jìn)行反萃取過程中PH>PI，當(dāng)PH值小于10時(shí)，萃取率較低;在PH>10.0時(shí)，隨著PH的升高，萃取率明顯升高，以PH值11.0的萃取效果為最好，但是當(dāng)PH>12時(shí)，萃取效率降低。

2.2 離子強(qiáng)度對萃取過程的影響 離子強(qiáng)度對蛋白質(zhì)萃取有幾方面的影響:一是離子強(qiáng)度增大后，反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度;二是反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性頭之間的斥力，使反膠束變小，從而使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入其中;三是離子強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí)，增大了離子向反膠束“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，使蛋白質(zhì)從反膠束內(nèi)被鹽析出來;四是鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可改變?nèi)芙庑阅埽}的濃度越高，其影響就越大。顯示離子濃度在0.1mol/L左右時(shí)萃取率較高，隨著濃度進(jìn)一步的提高，萃取率會(huì)發(fā)現(xiàn)明顯的降低。反萃離子強(qiáng)度在2mol/L左右回收率最高，高于或低于2mol/L回收率都會(huì)有明顯的降低。

2.3 AOT濃度對萃取過程的影響 根據(jù)一些文獻(xiàn)，AOT的最佳濃度適用范圍對于不同的目的產(chǎn)物不同，對于不同的萃取物質(zhì)，AOT濃度差別較大，故在本實(shí)驗(yàn)中AOT的濃度范圍作為一個(gè)重要因素進(jìn)行考慮。AOT濃度太低達(dá)不到臨界膠束濃度，不會(huì)形成反膠團(tuán)，對目的產(chǎn)物無萃取作用，但是AOT濃度太高，會(huì)造成其在有機(jī)相中不溶解，反膠團(tuán)形成渾濁溶液，多余AOT進(jìn)入水相，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還會(huì)造成試劑浪費(fèi)。而對于我們本次用的實(shí)驗(yàn)藥品，AOT濃度在80mmol/L以上會(huì)有一部分不溶于異辛烷中，因此對于后面的正交試驗(yàn)，選擇AOT濃度分別為50、60、70、80mmol/L。AOT濃度對萃取效率也有較大的影響。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得，AOT濃度在60mmol/L左右最佳。

3 結(jié)論

AOT濃度60mmol/L;以異辛烷作為有機(jī)溶劑;萃取pH為2.0;離子強(qiáng)度為0.1mol/L;反萃取PH為10;離子強(qiáng)度為1mol/L;萃取離子和反萃離子都為氯化鉀;萃取時(shí)間為15min;水浴振蕩250r/min;反萃時(shí)間為20min;水浴振蕩250r/min;有機(jī)相:水相=1:4(V:V);有機(jī)溶劑可以循環(huán)利用;萃取溫度為室溫;色氨酸回收率最高可以達(dá)到70%左右。

隨著人們生活水平的進(jìn)一步提高，色氨酸的需求量將會(huì)逐步增大。目前，在工業(yè)生產(chǎn)中大多采用的還是離子交換分離技術(shù)。但是，從相關(guān)報(bào)道的數(shù)量上來看，膜分離、液膜和反膠團(tuán)萃取研究較為熱門。可見，新方法在操作、分離效率和能力等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢，相信一定會(huì)有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn):

[1]竇光宇.色氨酸有益健康.家庭醫(yī)學(xué).2007(5):48.

[2]Krishna S H，Srinivas N D，Raghavarao K M，et al.Reverse micellesextraction for downstream processing of protein/enzymes.Adv Biochem Eng，2002，75:119~183.

[3]王履慶.食品營養(yǎng)分析實(shí)用手冊.北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社.1995.

[4]郎惠云，文輝忠，謝志海等.分析科學(xué)學(xué)報(bào).1997.13(3):225.

[5]杜連祥等.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社.1992.

[6]黃偉坤等.食品檢驗(yàn)與分析[M].北京:中國輕工出版社.1989.

[7]KatsumataR，Ikedam.[J]Bio/Tech.1993(11):921.

[8]劉亞萍，張關(guān)永.反向微膠團(tuán)萃取分離酪氨酸的研究.氨基酸和生物資源.2001.23(2):32～35.

[9]馮有勝，單振秀.細(xì)胞色素-C的親和反膠團(tuán)萃取研究.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2006.28(4):562～565.

[10]苑艷輝，錢和.AOT/異辛烷反膠束體系萃取豆豉纖溶酶的前萃工藝初探.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2006.27(2):38～42.

[11]魏玲，李學(xué)琴等.AOT(Tween80)/異辛烷反膠束體系在萃取番茄籽蛋白中的應(yīng)用研究.食品科技.2008(1):73～76.

[12]于艷春，鄭純智等.AOT/異辛烷反膠團(tuán)體系提取脂肪酶的研.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).1998(9):49～50.