結腸癌患者Ｗｎｔ信號通路的變化和作用

陳伙輝　汪森明　陳燕武　陳廣幸　吳鳳堅　張　健

【摘要】 目的 探討結腸癌患者Wnt信號通路的變化情況及其作用意義。方法 利用Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片對結腸正常黏膜組織和癌組織基因表達譜進行檢測，分析Wnt信號通路基因表達變化情況。 結果 Wnt信號通路中FRP、Frizzled、CK2、p53、PP2A、CKIα、JNK、CaMKII、CaN、c-jun、cyc-D等關鍵基因均呈下調，調控著細胞周期、基因轉錄等。結論 Wnt信號通路可能是調控結腸癌演變過程的重要信號通路之一。

【關鍵詞】 結腸癌; Wnt信號通路; 基因芯片お

The changes and and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients

CHEN Di-hui,WANG Shen-ming,CHEN Yan-wu.

The Second Peoples Hospital of Zhaoqing, Guangdong 526020, China

【Abstract】 Objective To study the changes and roles of Wnt signaling pathway in colon cancer patients.Methods The Human Genome U133 Plus 2.0 Array were used to analyze gene expression profiles in colon cancer and normal tissues.The genes related to Wnt signaling pathway were selected through genechip data analyasis.Results The key genes related to Wnt signaling pathway of FRP, Frizzled, CK2, p53, PP2A, CKIα, JNK, CaMKII, CaN, c-jun, cyc-D were down regulation, which controled the cell cycle and gene transcription of the vascular endothelial cell. Conclusion Wnt signaling pathway may be one of the most important pathway to control the development of colon cancer.

【Key words】 Colon cancer; Wnt signaling pathway; Genechip

結腸癌是我國常見惡性腫瘤之一，早期癥狀不明顯，無特異性，晚期表現為大便習慣改變，早期診斷、有效地判斷病情的發(fā)展、評估預后對降低結腸癌病死率十分重要。而進一步深入研究結腸癌發(fā)生機制，是更好防治結腸癌的必要基礎。近年研究發(fā)現Wnt(果蠅無翅基因wingless與小鼠基因Int-1的縮合)信號途徑調節(jié)控制著許多生命過程，參與細胞的癌變、增殖、分化、凋亡等^[1-2]。Wnt信號通路與結腸癌之間的關系研究有待進一步深入探討。本實驗旨在探討Wnt信號通路與結腸癌形成的部分分子作用機制，以期為結腸癌的臨床防治提供一種新的方法。

1 資料與方法

1.1 組織標本與分組 所有病例標本均取自肇慶市第二人民醫(yī)院內窺鏡室纖維結腸鏡摘除活檢標本，所有標本均得到患者的知情同意，所有患者檢查前均未接受化療、放療或其他針對腫瘤的治療。所取標本一部分在離體后60 s內迅速放入凍存管，置入液氮罐保存。其余所有標本均經病理組織學觀察證實。根據病檢結果分為正常組織組（A組）和結腸癌組（B組），每組各納入3例標本。

1.2 基因表達譜芯片檢測 TRIzol一步法提取上述2組標本總RNA，并進行純化和質檢。以各組總RNA為模板合成雙鏈cDNA；體外轉錄生成生物素標記的cRNA;純化和片段化處理后，取10 μg cRNA與Human Genome U133 Plus 2.0 Array進行雜交、洗脫、染色掃描檢測信號。

1.3 芯片圖像的采集與數據分析 采用Affymetrix掃描儀進行掃描。差異表達基因的判斷標準為：change為I，Ratio≥1，實驗組Detection為P的為上調基因；change為D，Ratio≤－1，對照組Detection為P的為下調基因。

1.4 pathway查詢分析 通過kegg pathway database (www.genome.jp/kegg/)查詢B vs A的差異基因參與的pathway信號通路。

2 結果

2.1 股靜脈組織的總RNA提取及電泳圖 各組股靜脈組織總RNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之間，行瓊脂糖凝膠電泳，28SRNA和18SRNA條帶整齊，28S與18S的吸光值之比約為2，制備的總RNA樣品合格（圖1）。

2.2 差異基因表達

2.2.1 概況 見表1。

2.2.2 pathway查詢結果 主要涉及了Wnt、MAPK、Focal adhension、Toll-like等多個信號通路。Wnt信號通路上游基因FRP；通路下游基因CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN以及通路末端基因fra-1、cyc-D均呈上調差異表達；而Wnt信號通路上游基因PLC則呈下調狀態(tài)。圖中是B vs A對比的差異表達基因映射入Wnt信號通路結果，紅色代表基因表達上調，藍色代表基因表達下調（圖2）。

3 討論

結腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢^[3]。在過去的幾十年，許多新藥和新方法的綜合應用使得結腸癌患者的生存率有了相當的提高。但結腸癌的轉移與復發(fā)仍然是臨床上面臨的主要難題，是治療失敗的主要原因。所以很有必要對結腸癌發(fā)生的分子機制進行深入研究。既往的研究表明結腸癌的形成是一個涉及多基因，多系統的疾病^[4,5]。這些基因構建成龐大的信號轉導系統，影響著腫瘤的演變狀態(tài)。

細胞外各種刺激通過相應介質與細胞膜上相應受體結合后誘發(fā)細胞內一系列級聯反應，使細胞增殖分化或周期停滯，構成細胞信號轉導系統。Wnt信號通路有3條主要分支^[6-9]：①經典的Wnt-β-catenin-LEF/TCF通路。這條通路激活后將募集細胞內β-catenin，后者活化轉移人細胞核，與轉錄因子LEF/TCF等共同作用激活特異基因的轉錄；②細胞極性通路。調控細胞骨架的重排；③Wnt/Ca2+通路，通過鈣依賴性激酶、鈣調蛋白和轉錄因子NF-AT起作用。β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，避免β-catenin經泛素一蛋白酶體系統降解，導致β-catenin在細胞質內聚集，聚集到一定量后轉位到胞核中，與轉錄因子TCF/LEF結合而激活下游靶基因的轉錄，引起細胞增殖加快、凋亡抵抗。在此系統中，癌基因的激活和抑癌基因的失活刺激細胞加速增殖與無限生長或抑制凋亡，導致腫瘤發(fā)生。有研究表明^[10,11]：Wnt-β-catenin通路調節(jié)TCF/LEF基因在一些腫瘤中廣泛被過度激活，例如黑素瘤、肝細胞癌、毛囊癌、成神經管細胞瘤等；對Wnt通路的組分結構功能以及相互作用的研究，發(fā)現Wnt-β-catenin與TCF的結合位點與APC、cadherin和Axin不同，可以為分子藥物設計提供潛在的靶位，該通路的抑制劑可能成為新的抗癌前體藥物。

本實驗研究之信號通路顯示，差異表達之基因均呈現下調趨勢，有FRP、CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN、fra-1、cyc-D、PLC等。這些基因通過網絡傳遞信息，相互協調、相互調控。FRP為Wnt信號通路的上游基因，在機體受到外界的刺激后，呈現下調抑制狀態(tài)，調控影響著下游基因，如CK2、p53、PKA、PP2A、β-catenin、CKIα、Rac、CaMKII、CaN等，而這些基因將不同信號傳導通路介導的信號加以整合,起著多種信號的交匯點或共同通路的作用。末端效應基因如fra-1、cyc-D等基因異常表達，調控細胞的細胞周期和基因轉錄等，進而影響細胞生長狀態(tài)與功能。

本實驗提示：結腸癌發(fā)生有多個基因表達的異常表達，通過所編碼的蛋白質表達質與量的改變，使細胞的生長調控失常，代謝狀態(tài)異常等，最終導致了細胞的生長失去正常調控，向惡性轉化。臨床上如干擾其中的轉導途徑，就有可能預先中止腫瘤的發(fā)生或者減輕腫瘤的危害程度，從而為臨床結腸癌的防治提供新的方向和靶點。

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