鮑曼不動桿菌耐藥性及碳青霉烯酶的研究

馮紅軍　牛麗林　李花茹　付玉軍　牛勝利　米彩鋒

【摘要】 目的 了解鮑曼不動桿菌耐藥譜及碳青霉烯酶的研究。方法 用VITEK60型全自動藥敏分析系統鑒定藥敏系統及紙片擴散法進行藥敏實驗；PCR擴增和測序分析檢測碳青霉烯酶VIM、IMP、OXA-23和OXA-24。結果 217株鮑曼不動桿菌中頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低，其次是亞胺培南，再者是頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦；頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶的中介率分別是27.6%和19.8%； 20株亞胺培南耐藥菌中， PCR 擴增VIM、IMP和OXA-24均陰性；OXA-23基因擴增顯示19株（95%）陽性，PCR產物并經序列分析證實為OXA-23。結論 碳青霉烯類抗生素的長期廣泛應用使鮑曼不動桿菌的耐藥率不斷升高；產OXA-23型β-內酰胺酶是本院鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因。

【關鍵詞】 鮑曼不動桿菌；碳青霉烯酶

The resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter baumannii

FENG Hong-jun, NIU Li-lin, LI Hua-ru,et al.The First Peoples Hospital of Pingdingshan， Henan 467000，China

【Abstract】 ObjectiveTo investigate the resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter Baumannii（Ab）.Methods Identification and analyses all specimens were identified by VITEK- 60, drug resistances were detected by VITEK- 60 , the drug resistance to SCF were detected by Kirby -Bauer test. PCR and DNA sequencing were performed to determine VIM，IMP，OXA-23 and OXA-24 β-lactamase. Results 217 strains, the resistance rate to sulperazone in 217 strains is the lowest, then to the Imipems ;The mid-drug-resistance rate of the sulperazone is 27.6%, and the ceftazidimes is 19.8%. Of the 20 imipenem resistance strains, VIM、IMP and OXA-24 β-lactamase genotype were all negative, PCR and sequencing found 19 strains（95%）produced OXA-23.Conclusion The resistance rates is increasing to advance as longer-term or broad to use carbopenem; OXA-23 production is the important resistance mechanism in Imipenem.

【Key words】 Acinetobacter baumannii；Carbapenemases

鮑曼不動桿菌是引起院內感染的重要病原菌,它對多種抗菌藥物耐藥, 臨床上治療比較困難。亞胺培南對不動桿菌有較好的抗菌活性, 往往是鮑曼不動桿菌院內感染的首選抗菌藥物^[1]。但隨著亞胺培南在臨床的廣泛應用, 對亞胺培南耐藥的不動桿菌也日益增多^[2]。為了解亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌在本院的耐藥性及流行情況,筆者對在本院收集到的亞胺培南耐菌株進行耐藥性分析, 并對碳青霉烯酶基因進行了檢測。

1 材料和方法

1.1 收集本院2005年12月至2006年12月間住院患者各類標本中分離出多重耐藥菌株217株，其中來自痰液的159株，瘡口分泌物21株，尿液7株，腹水6株，血液5株，其他標本26株。并取對亞胺培南耐藥菌株20株進行碳青霉烯酶基因進行了檢測。

1.2 分離培養 按《全國臨床檢驗操作規程》進行細菌分離培養。

1.3 質控菌株 大腸埃希菌(ATCC 25922)，銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

1.4 鑒定和耐藥譜的分析 用VITEK60型全自動藥敏分析系統鑒定和檢測鮑曼不動桿菌的耐藥性，用K-B紙片擴散法檢測鮑曼不動桿菌對SCF的耐藥性。頭孢哌酮/舒巴坦折點參考頭孢哌酮標準。

1.5 酶基因PCR檢測 各酶基因擴增所用引物序列為：blaIMP-A(CGGCC(G/T) CAGGAG(A/C)G(G/T)CTTT)和 blaIMP-B(AACCAGTTTTGC(C/T)TTAC(C/T)AT); blaVIM-A(AT TCCGGTCGG(A/G)GAGGTCCG)和blaVIM-B(GAGCAAGTCTAGACCGCCCG); blaOXA-23-A(GATGTG TCATAGTATTCGTCG)和blaOXA-23-B(TCACAACAACTAAAAGCACTG); blaOXA-24-A(CAAGAGCTTG CAAGACGGACT和blaOXA-24-B(TCCAAGATTTTCTAGC(A/G)ACTTATA。IMP-、VIM- 、OXA-23-、 OXA-23型金屬酶基因PCR反應參數為93℃預變性2 min，然后按93℃1 min→55℃1 min→72℃1 min。共循環35周期。最后一個72℃延長至2 min。產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果。PCR產物純化后測序。

2 結果

2.1 多重耐藥菌的耐藥性分析 在217株多重耐藥鮑曼不動桿菌中，頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低（24.4%），其次是亞胺培南（39.1%），再者是頭孢他啶（52.1%）和哌拉西林/他唑巴坦（55.7%）。 但頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶的中介率分別是27.6%和19.8%。與文獻報道不一致^[3]見表1。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測顯示 20株菌株中，經OXA-23特殊引物經擴增后，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在19株中出現了1 067 bp的陽性條帶（見圖1），此PCR 產物經純化后測序并與GenBank數據庫公布的序列進行比較后發現, 所有PCR產物100%與OXA-23 基因同源。未能擴增出VIM、IMP和OXA-24基因。同時擴增了4株亞胺培南敏感株，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實OXA-23均為陰性。

3 討論

近年來隨著β-內酰胺類抗生素等廣譜抗菌藥物的廣泛使用，誘導了大量鮑曼不動桿菌耐藥株的產生，其臨床分離率也越來越高，并形成了對單一抗菌藥物耐藥到多重耐藥甚至全耐，由低耐藥率到高耐藥率的發展和變遷。本研究中顯示，鮑曼不動桿菌對第一、二代頭孢菌素幾乎耐藥，對三代頭孢菌素除頭孢他定稍低外，其他都達60％以上，并且對大多數β-內酰胺類耐藥率有上升的趨勢。對頭孢他啶的耐藥率較低，可能由于頭孢他啶對β-內酰胺酶有高度穩定性和有效血藥濃度持續時間較短的原因。在加入β-內酰胺酶抑制劑舒巴坦、他唑巴坦后，抗菌藥物的耐藥率下降，成為治療多重耐藥鮑曼不動桿菌的一線藥物。哌拉西林和氨芐西林同屬青霉素類，哌拉西林本身抗菌活性強于氨芐西林，但氨芐西林/舒巴坦的協同作用優于哌拉西林/他唑巴坦。表明所產生的β－內酰胺酶活性多能被舒巴坦抑制, 但其而較少被克拉維酸和他唑巴坦抑制，舒巴坦對β-內酰胺酶的抑制作用優于他唑巴坦。這可能與他唑巴坦抑酶譜窄有關。

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解亞胺培南或美羅培南的一類β-內酰胺酶，它包括Ambler分子分類為A、B、D的3類酶。從不動桿菌中分離出的碳青霉烯酶按Ambler分類法主要分為B和D兩類。B類酶主要是指金屬酶。金屬酶需要金屬離子如Zn2+等的轉移表現其催化活性。根據氨基酸的同源性，Bush又把金屬酶分成三組結構亞型B1, B2, B3^[3]在鮑曼不動桿菌中發現的主要是B1亞型，包括IMP類以及VIM類。目前在不動桿菌屬中只發現了四種IMP類金屬酶IMP-1, IMP-3和IMP-4, IMP-7^[4，5]。其活性不被克拉維酸等抑制劑所抑制,但可被EDTA所抑制。它們具有很強的水解碳青霉烯類抗菌藥物的能力，是導致臨床治療失敗的又一大原因。2002年韓國Yum等^[6]在不動桿菌中又發現了位于整合子中的VIM-2，與IMP酶的同源性<30%，但兩者具有相同的動力學特征，能水解除氨曲南以外的所有的β-內酰胺類抗菌藥物，其基因也位于有轉移能力的整合元件上。D類碳青霉烯酶即OXA酶,屬Bush-J-M功能分類2 d群。目前不動桿菌中已發現的有OXA-23、OXA-4、OXA-25、OXA-26、OXA-27、OXA-40。OXA-23對苯唑西林具有很強的水解活性，但對氨芐西林卻相對較弱，而OXA-27對這類抗菌藥物都只具有弱的水解活性。它們的活性不能被克拉維酸完全抑制，可被氯離子強烈抑制。此外，OXA-23的保守序列的點突變也與它對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥有關^[7]。

本研究中未檢出VIM、IMP和OXA-24基因,但有95%的菌株經PCR產物電泳和測序證實產OXA-23型碳青霉烯酶，而OXA-23陰性的1株菌株經多次檢測MIC值均為臨界值（16 ug/ml）。本組菌對亞胺培南的高耐藥率和高MIC值，可能還與其他耐藥機制參與有關。有研究發現OXA-24對亞胺培南、米諾配能等碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，分子克隆發現這類細菌染色體上編碼碳青霉烯類抗菌藥物水解酶，同時伴有22 kd和33 kd的外膜孔蛋白的低表達和抗生素靶位的改變^[8]。

隨著抗菌藥物的廣泛應用，鮑曼不動桿菌的耐藥現狀日趨嚴重，加強鮑曼不動桿菌耐藥性監測、進一步深入研究細菌的耐藥機制,從預防耐藥性和控制感染角度出發不斷研制和開發新的抗菌藥物和非抗生素類抗菌藥物,將成為今后的工作重點。

參 考 文 獻

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［5］ Yu-Wai Chu,Mariya Afzal-Shah, Elizabeth TS,et al. IMP-4, a Novel Metallo-Lactamase from Nosocomial Acinetobacter spp. Collected in Hong Kong between 1994 and 1998. Antimicrob Agents Chemother， 2001,45(3):710-714.

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［8］ Bouq Cervero Q，Diminguez MQ， et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter baumannii strain with a carbaprenem- hydrolyzing enzyme high-lever carbapenem resistancem in a baumanniiis not due solely to the presence of β-Lactamases. J Clin Microbiol， 2000,38(9):3299-3305.