雷公藤單加氧酶基因全長克隆及表達(dá)分析

周家偉 劉雨佳 胡添源 張逸風(fēng) 高偉 黃璐琦

摘要 目的：單加氧酶（Monooxygenase，MO）是一類通過在底物上加一個氧原子的加氧酶，在動植物體內(nèi)參與多種代謝途徑。本實驗致力于從雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中克隆得到單加氧酶基因cDNA全長，并對克隆得到的MO基因進(jìn)行初步的功能分析。方法：通過對雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到MO基因片段設(shè)計特異性引物，克隆MO基因cDNA全長，通過生物信息學(xué)方法對得到的MO基因進(jìn)行分析，主要包括多重序列比對，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和構(gòu)建進(jìn)化樹分析等。結(jié)果：根據(jù)分析結(jié)果TwMO基因全長為2 193 bp，共編碼507個氨基酸，等電點為8.84，相對分子質(zhì)量為55.20 kDa，多重序列比對顯示它與其他植物的MO基因具有較高的同源性。雷公藤懸浮細(xì)胞經(jīng)外源茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后，實時熒光定量結(jié)果顯示，TwMO的表達(dá)量明顯增加，并在48 h達(dá)到最高，提示TwMO基因與雷公藤的次生代謝產(chǎn)物的生成有關(guān)。結(jié)論：本研究首次從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到MO基因，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 雷公藤；克隆；基因；單加氧酶；表達(dá)分析

Abstract Objective：Monooxygenase （MO） is a kind of enzymes that can incorporate one atom of oxygen into the substrates in many metabolic pathways.This study aimed to clone the full-length cDNA of a MO from the transcriptome data of Tripterygium wilfordii and analyze its function.Methods：The full-length cDNA of monooxygenase （TwMO） was cloned from the transcriptome data of Tripterygium wilfordii by designing specific primers.The TwMO gene was then analyzed by a series of bioinformatics analysis.Results：It showed that the full length of TwMO cDNA was 2193 bp encoding 507 amino acids.The theoretical isoelectric point was 8.84 and the molecular weight was about 55.20 kDa.Sequence alignment and phylogenetic analysis demonstrated that TwMO had relative close relationship to MO from other species of plants.The relative expression level of TwMO after MeJA inducing was up-regulated and highest at 48 h，which suggested its regulatory role in special metabolites biosynthesis.Conclusion：This work laid the foundation for further studying the function of this monooxygenase in Tripterygium wilfordii.

Key Words Tripterygium wilfordii； Clone； Gene； Monooxygenase； Expression analysis

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.005

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）為衛(wèi)矛科（Celastraceae）雷公藤屬植物，其干燥根或根的木質(zhì)部作為中藥雷公藤使用。中藥雷公藤在我國具有悠久的用藥歷史[1]，其具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、解毒殺蟲、消腫散結(jié)等功效[2]。雷公藤中的活性成分主要分為萜類和生物堿類，現(xiàn)代藥理研究表明雷公藤中的有效成分如雷公藤甲素和雷公藤紅素等具有抗腫瘤[3]，抗炎抗風(fēng)濕[4]和神經(jīng)營養(yǎng)活性[5]等作用，另有研究報道雷公藤紅素可以使正常肥胖小鼠體質(zhì)量下降45%，從而達(dá)到減肥的作用[6]。雷公藤紅素和雷公藤甲素與青蒿素、辣椒素和姜黃素被列為最有可能被開發(fā)成為現(xiàn)代藥物的5種傳統(tǒng)天然藥用化合物[7]。

加氧酶屬于氧化還原酶類，可以分為雙加氧酶和單加氧酶。單加氧酶也稱作羥化酶或羥氧酶，可以使底物和一個氧原子結(jié)合，而另一氧原子在氫供體（NADPH等）的作用下生成水[8]。細(xì)胞色素P450屬于單加氧酶中的一類，它參與多種體內(nèi)代謝過程，與藥物和毒物的代謝密切關(guān)系。此外，P450家族基因?qū)χ兴幹械幕钚猿煞值暮铣善鹬P(guān)鍵的作用，參與多種中藥活性成分的生物合成過程[9-10]。鯊烯環(huán)氧化酶也屬于單加氧酶，它是三萜和甾醇生物合成上的關(guān)鍵酶基因，它的活性和功能影響著三萜和甾醇的生物合成。鯊烯在鯊烯環(huán)氧化酶和其輔酶細(xì)胞色素P450還原酶（Cytochrome P450 Reductase，CPR）的作用下生成環(huán)氧鯊烯[11]，環(huán)氧鯊烯再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為三萜或甾醇類物質(zhì)。在植物中，鯊烯環(huán)氧化酶通過影響植物的甾醇和三萜類活性成分的合成進(jìn)一步影響植物的生長和發(fā)育以及應(yīng)對生物和非生物的壓力。研究表明在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的環(huán)氧鯊烯酶SE1基因影響著擬南芥的根和種子的發(fā)育而SE3基因影響胚芽的發(fā)育和大小[12-13]。

鑒于單加氧酶對藥用植物的生長發(fā)育和中藥活性成分生物合成的重要性，本研究首次從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到一條MO基因，該基因全長2193 bp，具有完整的開放閱讀框，共編碼507個氨基酸。通過生物信息學(xué)分析，初步分析了該基因編碼蛋白的生物學(xué)功能。此外，本文研究了TwMO基因在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的表達(dá)方式，為進(jìn)一步研究TwMO基因在雷公藤中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 2-16K型低溫冷凍離心機(jī)（Sigma公司），MM400型混合型球磨儀（Retsch公司），VeritiTM 96孔梯度PCR儀（ABI公司），GBOXHR型紫外凝膠成像分析儀（Syngene公司），QuantStudio 5 Real-Time PCR System（ABI公司）等。

1.2 試劑 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Thermo公司生產(chǎn)），F(xiàn)ast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、快速小提質(zhì)粒試劑盒和RNA純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)），Easy taq酶（北京全式金生物技術(shù)公司生產(chǎn)），Eastep Super總RNA提取試劑盒（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)），PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)），2xPhusion HF PCR Master Mix（NEB公司生產(chǎn)），KAPA SYBR FAST qPCR Kit MasterMix（2X）Universal試劑盒（Kapa biosystems公司生產(chǎn)）。菌株和質(zhì)粒：Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt Zero vector（北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.3 分析樣品 雷公藤懸浮細(xì)胞由本實驗室繼代保存[14]。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤總RNA的提取和精制 將雷公藤懸浮細(xì)胞加入茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)（終濃度為50 μM），分別于誘導(dǎo)后12、24、48 h取材，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱。取各誘導(dǎo)時間點雷公藤懸浮細(xì)胞0.4～0.6 g，液氮環(huán)境下研磨粉碎。采用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取3個時間點懸浮細(xì)胞的總RNA，用RNA純化試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行精制。通過凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。

2.2 TwMO cDNA全長克隆 cDNA第一鏈以精制后的總RNA為模板，通過SMARTerTM Race cDNA，Amplification Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄后得到。根據(jù)雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋，篩選出MO基因片段，對MO基因片段設(shè)計特異性擴(kuò)增引物。見表1。以獲得的cDNA第一鏈為模板，在VeritiTM 96孔梯度PCR儀上進(jìn)行全長擴(kuò)增。50 μL的反應(yīng)體系：1 μL模板DNA、25 μL的2xPhusion HF PCR Master Mix、2.5 μL的正向引物、2.5 μL的反向引物、ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳分離后，目標(biāo)條帶用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，取1 μL pEASY-Blunt Zero載體與4 μL回收產(chǎn)物在PCR儀中25 ℃反應(yīng)15 min后，將連接產(chǎn)物與50 μL的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min后，42 ℃水浴45 s，冰浴2 min后加入500 μL的LB培養(yǎng)基，37 ℃，180轉(zhuǎn)培養(yǎng)1 h，涂布于LB+氨芐培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜。單克隆菌經(jīng)菌液PCR鑒定后，陽性克隆送公司測序（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），由測序結(jié)果獲得TwMO cDNA全長序列。

2.3 雷公藤TwMO基因生物信息學(xué)分析 將測序得到的TwMO序列結(jié)果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上Blast搜索蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫，并在ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）上查找開放閱讀框（ORF）和翻譯成氨基酸序列。主要采用一些網(wǎng)上軟件包進(jìn)行生物信息學(xué)分析[15]，如采用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對，ExPASy在線服務(wù)器的Compute PI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測理論等電點與相對分子量，TRMHMMserver v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜域分析，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三維同源建模。用DNAMAN軟件、ClustalW軟件和MEGA 6軟件分別對TwMO基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，與其他來源的MO氨基酸序列進(jìn)行比較和構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.4 雷公藤TwMO基因的表達(dá)分析 雷公藤懸浮細(xì)胞經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，取不同誘導(dǎo)時間點（0，4，12，24，48，72 h）的雷公藤懸浮細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取不同處理時間點的懸浮細(xì)胞的總RNA。用FastQuant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以雷公藤actin基因作為內(nèi)參，進(jìn)行TwMO基因相對表達(dá)檢測，引物設(shè)計。見表1。反應(yīng)體系：2×Fast qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正反引物（10 mmol/L）各0.4 μL，PCR-grade water 7.8 μL，50×Rox High 0.4 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)：65～95 ℃做溶解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后對熒光值擴(kuò)增曲線和融解曲線進(jìn)行分析。生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次，采用2-△△CT法分析結(jié)果。

2.5 結(jié)果

2.5.1 雷公藤TwMO全長cDNA的獲得 由雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過全長PCR克隆得到TwMO基因的cDNA全長序列為一條2 193 bp的cDNA特異性片段，結(jié)果。見圖1。

2.5.2 雷公藤MO基因序列分析 通過ORF Find在線軟件對TwMO基因全長cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測其共編碼507個氨基酸，且含有完整開放閱讀框（Open reading frame，ORF），位于243～1 766 bp區(qū)域；序列的1～243 bp為5URT，1 766～2 193 bp為3 URT。Blast的結(jié)果顯示TwMO與毛果楊Populus trichocarpa 81%相似，與甜橙Citrus sinensis 79%相似，與胡桃Juglans regia 77%相似，與麻風(fēng)樹Jatropha curcas 75%相似，與沒藥葉天竺葵Pelargonium myrrhifolium 75%相似等。Interpro結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示TwMO有與FAD結(jié)合有關(guān)的FAD/NAD（P）-binding domain（53～326，374～451）功能域。見圖2。DANMAN對沒藥葉天竺葵（AKF43264）、長果種麻黃Corchorus olitorius（OMO88316）、土瓶草Cephalotus follicularis（GAV67558）、桃蝶木天竺葵Pelargonium tetragonum（AKF43266）、天竺葵Pelargonium x hortorum（AKF43268）、馬德拉老鸛草Geranium maderense（AKF43250）、暗花老鸛草Geranium phaeum（AKF43251）和野大豆Glycine soja（KHN10936）的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果表明TwMO與其他植物的MO氨基酸序列具有較大的相似性，平均為82.46%。見圖3。

2.5.3 TwMO氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將雷公藤MO氨基酸序列與GenBank中其他30種生物的MO氨基酸序列進(jìn)行比對分析，在軟件MEGA6中采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行聚類分析。見圖4。TwMO在本文所選蛋白中與土瓶草的MO基因親緣關(guān)系較近。

2.5.4 TwMO理化性質(zhì)和3D結(jié)構(gòu)預(yù)測 EsPASy在線軟件對TwMO氨基酸序列的理化性質(zhì)分析，結(jié)果為TwMO的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為55.2 kDa，等電點為8.84?？缒び蚍治鼋Y(jié)果顯示其為膜蛋白。見圖5。TwMO三維同源模型以4n9x.1.A蛋白為模板構(gòu)建TwMO蛋白的三級結(jié)構(gòu)，該蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型。見圖6。

2.5.5 TwMO誘導(dǎo)表達(dá)分析 MeJA是一種廣泛存在于植物中的防御激素，已有研究報道外源添加MeJA可以激發(fā)植物防御基因的表達(dá)，可以誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高次生代謝產(chǎn)物在植物體中的產(chǎn)量[16-17]，使植物應(yīng)對外界壞境的脅迫。根據(jù)實時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)后TwMO基因表達(dá)實驗的數(shù)據(jù)，采用2-△△CT相對定量表達(dá)分析。見圖7。實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MeJA誘導(dǎo)后，雷公藤TwMO基因表達(dá)量迅速上調(diào)，在48 h達(dá)到最大，提示該基因與雷公藤中的活性成分的生物合成相關(guān)。

3 討論

由于單加氧酶基因不僅對植物的生長發(fā)育起著重要的作用，同時也參與了中藥活性成分的生物合成過程。研究單加氧酶的生化功能有助于通過分子水平揭示藥用植物中活性成分的生物合成機(jī)制。本研究首次從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到一條MO基因。為了能進(jìn)一步研究其具體的生化功能，本研究通過生物信息學(xué)分析方法對其核苷酸和氨基酸序列了進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TwMO與已報道的MO基因具有很高的相似性，并且TwMO具有MOs所共有的與FAD結(jié)合有關(guān)的FAD/NAD（P）-binding domain功能域。此外，外源的MeJA激素誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞后，實時熒光定量對TwMO基因的表達(dá)分析結(jié)果表明，TwMO在誘導(dǎo)后呈上升的趨勢，表明其受到外源MeJA的調(diào)控，可能與植物的次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)。本研究克隆了TwMO的cDNA全長序列并對其理化性質(zhì)和具體的生化功能進(jìn)行的初步預(yù)測，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]高偉，劉夢婷，程琪慶，等.雷公藤的本草考證[J].世界中醫(yī)藥，2012，7（6）：560-562.

[2]劉為萍，劉素香，唐慧珠，等.雷公藤研究新進(jìn)展[J].中草藥，2010，41（7）：1215-1218.

[3]Yang H，Chen D，Cui Q C，et al.Celastrol，a triterpene extracted from the Chinese “Thunder of God Vine” is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Research，2006，66（9）：4758-4765.

[4]Astry B，Venkatesha S H，Laurence A，et al.Celastrol，a Chinese herbal compound，controls autoimmune inflammation by altering the balance of pathogenic and regulatory T cells in the target organ[J].Clinical Immunology，2015，157（2）：228-238.

[5]Lu L，Li F，Wang X.Novel anti-inflammatory and neuroprotective agents for Parkinson′s disease[J].Cns & Neurological Disorders Drug Targets，2010，9（9）：232-240.

[6]Junli L，Jaemin L，Mario Andres S H，et al.Treatment of obesity with celastrol[J].Cell，2015，161（5）：999-1011.

[7]Corson T W，Crews C M.Molecular understanding and modern application of traditional medicines：triumphs and trials[J].Cell，2007，130（5）：769-74.

[8]Harayama S，Kok M，Neidle E L.Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases[J].Annual Review of Microbiology，1992，46（46）：565-601.

[9]Guo J，Ma X，Cai Y，et al.Cytochrome P450 promiscuity leads to a bifurcating biosynthetic pathway for tanshinones[J].New Phytologist，2016，210（2）：525-534.

[10]Zhao Q，Cui M Y，Levsh O，et al.Two CYP82D Enzymes Function as Flavone Hydroxylases in the Biosynthesis of Root-Specific 4′-Deoxyflavones in Scutellaria baicalensis[J].Molecular Plant，2017，11（1）：135-148.

[11]Porter TD.Electron Transfer Pathways in Cholesterol Synthesis[J].Lipids，2015，50（10）：927-936.

[12]Rasbery JM，Shan H，Leclair RJ，et al.Arabidopsis thaliana squalene epoxidase 1 is essential for root and seed development[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（23）：17002-17013.

[13]Laranjeira S，Amorim-Silva V，Esteban A，et al.Arabidopsis Squalene Epoxidase 3（SQE3）Complements SQE1 and Is Important for Embryo Development and Bulk Squalene Epoxidase Activity[J].分子植物：英文版，2015，8（7）：1090-1102.

[14]周家偉，劉雨佳，胡添源，等.雷公藤PTEN基因全長克隆及表達(dá)分析[J].中草藥，2017，48（7）：1391-1396.

[15]胡添源，蘇平，張逸風(fēng)，等.雷公藤單萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表達(dá)分析[J].中國中藥雜志，2017，42（7）：1312-1318.

[16]Geyter ND，Gholami A，Goormachtig S，et al.Transcriptional machineries in jasmonate-elicited plant secondary metabolism[J].Trends in Plant Science，2012，17（6）：349-359.

[17]Misra RC，Ghosh S.Methyl jasmonate-elicited transcriptional responses and pentacyclic triterpene biosynthesis in sweet basil[J].Plant Physiology，2014，164（2）：1028-1044.