如何做好組織培養(yǎng)生產(chǎn)過程中污染防止工作

祁恒佐

摘要:組織培養(yǎng)的英文為mericlone,是meri(meristem=分裂組織)+ clone (營養(yǎng)繁殖系)的合成語。又稱植物克隆,指通過無菌操作把植物體的外植體接種于人工配制的培養(yǎng)基上。在人工控制的環(huán)境條件下進行離體培養(yǎng)。而污染是植物組織培養(yǎng)中的三大難題之一,普遍發(fā)生于不同的植物組織、器官中,控制污染是組培苗生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。文章就組織培養(yǎng)過程中的污染來源及防止作了些探討。

關(guān)鍵詞:組織培養(yǎng);生產(chǎn)過程;污染來源

中圖分類號:Q943文獻標識碼:A

文章編號:1674-1145(2009)20-0102-02

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,組培生產(chǎn)技術(shù)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用速度很快,我國組培工業(yè)化生產(chǎn)始于20世紀70年代,近年來這項技術(shù)的應用范圍十分廣泛,尤其在作物育種、苗木及花卉的脫毒和快繁等方面更具其他技術(shù)手段所無法比擬的優(yōu)勢。雖然組織培養(yǎng)技術(shù)操作并不難,但對一些技術(shù)環(huán)節(jié)的要求卻十分嚴格,稍有疏忽便會延誤實驗進程,甚至導致整個試驗失敗,為此我們必須重視在組織培養(yǎng)生產(chǎn)過程中污染帶來的危害。以下就組織培養(yǎng)過程中的污染來源及防止作一些探討。

一、在組織培養(yǎng)生產(chǎn)過程中污染的來源

(一)外植體自身帶菌

許多植物都是栽培在室外,而空氣環(huán)境中有大量微生物存在,這些微生物可通過植物自然的孔口或傷口進入植物內(nèi)部,也有一些兼性腐生菌,可由外植體或通過相應的侵入機制侵入植株內(nèi)部,如果在接種操作前對這些認識不足,對外植體消毒不嚴,就很容易發(fā)生污染現(xiàn)象。

(二)培養(yǎng)基或接種工具滅菌不徹底

在對培養(yǎng)基滅菌過程中,如果滅菌時間過短、滅菌時溫度達不到要求、滅菌鍋壓力記數(shù)不準等因素都有可能導致培養(yǎng)基滅菌不徹底,使一些病原微生物殘留在培養(yǎng)基中,一旦接種后就會造成污染。使用滅菌不徹底的接種工具,滅過菌的接種工具存放時間過長,都會導致在生產(chǎn)中造成污染,所以生產(chǎn)中要做好培養(yǎng)基和接種工具的滅菌和消毒工作。

(三)接種室消毒不嚴

在組培生產(chǎn)過程中,除了植物本身外,大部分污染來源便是來自接種操作室。因為在接種操作室中,未過濾的空氣中含有大量的微生物,這些微生物可隨著操作人員或植株接觸時而發(fā)生污染,所以接種室消毒不嚴,也易引發(fā)污染發(fā)生。

(四)人員因素

在整個操作室內(nèi),人員是最大的帶菌者,其不管在毛發(fā)或是衣服等,都隱藏著數(shù)不清的微生物。這些微生物的存在都可能造成一定的危害。為此在進入操作室前,接種人員的工作服、鞋帽都必須進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽,接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,這樣在一定程度上可減輕污染的危害。

(五)超凈工作臺上的濾網(wǎng)過濾不徹底

超凈工作臺使用過久,或保養(yǎng)不當,而造成濾網(wǎng)壞掉或灰塵過多,導致在接種操作時對空氣過濾不徹底,也易產(chǎn)生污染。

(六)栽培過程污染

在栽培室,組培瓶外和外界氣體交換時,亦會有一些微生物進入。污染幾率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

二、防止污染的方法

(一)認真做好外植體的選擇和消毒工作,防止外植體帶菌

對外植體的選擇要考慮選擇的時間和部位,盡量選取帶菌少的材料,在時間上一般在植株的生長旺盛季節(jié)如春季和秋季病原微生物數(shù)量相對要少些,對于外植體的部位一般以幼嫩的部位較好。另外要做好外植體的消毒工作,目前外植體消毒常用藥劑有:70 %～75%的乙醇溶液,0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升汞溶液,選用何種消毒劑和消毒時間要根據(jù)外植體的幼嫩程度和部位確定,一般要求既將外植體表面的微生物殺死,又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。在生產(chǎn)實踐中防止外植體污染,也可實行多次滅菌和交替滅菌相結(jié)合的辦法,最終達到消滅雜菌的目的。

(二)改善接種室和培養(yǎng)室的環(huán)境條件,保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔無菌

與外植體自身帶菌所產(chǎn)生的污染相比,操作污染和環(huán)境污染是可以克服的。在組培生產(chǎn)中,真菌的污染一般與環(huán)境有關(guān),細菌污染與接種材料及工具有關(guān)。生產(chǎn)中要通過定期做好對接種室與培養(yǎng)室消毒工作,減少環(huán)境中的微生物數(shù)量,減輕對污染的危害,為此,在接種前接種室要認真做好消毒工作,且超凈工作臺在接種前,認真擦洗,紫外燈要開20～30min左右。培養(yǎng)室的相對濕度應控制在70%左右,對每件物品放到超凈工作臺上,都要用75%酒精認真擦洗一遍,方可放到臺面上,只有這樣在一定程度上可控制污染程度。

(三)操作人員嚴格遵守無菌操作規(guī)程

接種人員在接種操作中,應嚴格遵守無菌操作規(guī)范要求。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品要定期進行濕熱滅菌,在超凈工作臺的操作區(qū)內(nèi),不要放入過多的待用物品,避免氣流被擋住產(chǎn)生污染。定期清洗或更換超凈工作臺過濾器,接種前15～20min打開風機,風速調(diào)整到20～30m/min,并對臺面用75%酒精噴霧消毒,工作人員進入操作室前必須對工作服、鞋帽進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽,接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,只有接種過程中嚴格遵守操作要規(guī)范,才可避免因人為(轉(zhuǎn)上頁)(接下頁)因素造成污染。

(四)培養(yǎng)基及接種工器具要嚴格滅菌,確保滅菌質(zhì)量

在對培養(yǎng)基和接種工具滅菌時,要先檢查滅菌鍋的使用情況,發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修。在滅菌過程中要絕對保證滅菌應達到的壓力、時間,確保滅菌質(zhì)量。一般要求壓力應達到0.1個大氣壓,時間維持在15～20分鐘,并且壓力表降到零后不能馬上出鍋,防止外界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)引起真菌污染,應待鍋內(nèi)稍冷卻后再出鍋。對組培生產(chǎn)過程中培養(yǎng)容器封口采用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料,在使用前要認真做好清冼和消毒工作,不符合要求堅決不用。在分裝培養(yǎng)基時,勿觸瓶口,防止培養(yǎng)基粘在瓶口上,引起污染,瓶口封好后要檢查封口是否破損,扎瓶口位置適當,松緊適宜。對已污染組培瓶要經(jīng)高壓滅菌后再清洗。

(五)在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素

這是目前較常用的方法,抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中,也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。但植物種類不同,所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同,因此必須對不同植物采用不同的抗生素的種類、濃度和處理時間進行實驗探討。一般情況下,為消除革藍氏陽性菌對有些木本植物污染莖段組培苗,可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素、頭孢等混合物,可使細菌完全被消除。另外用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內(nèi)生菌也有非常明顯的效果。

(六)利用病毒在植株體內(nèi)分布不均勻的原理,生產(chǎn)脫毒苗

主要是針對在植物內(nèi)部寄生的病毒,因病毒在生長點區(qū)域幾乎不存在,且病毒也難以長到頂芽的分生組織,所以切取頂芽的分生組織進行組織培養(yǎng),通過組織培養(yǎng)技術(shù)就可培養(yǎng)成無病毒植株,而且脫毒效果好,后代遺傳性穩(wěn)定,所以是目前生產(chǎn)無病毒苗最安全、最重要的一條途徑。

(七)利用培養(yǎng)基中高鹽或高糖的濃度,抑制微生物的生長

在培養(yǎng)基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長,或單寧酸存在時也可以達到抑制微生物生長的效果。

(八)減少培養(yǎng)基中的某些有機成分,可抑制微生物的生長繁殖

培養(yǎng)基中有機物如VB1、VB6、煙酸等有機成分,是某些細菌生長的必需物質(zhì),除去這些有機物后,細菌無法生長發(fā)育,逐漸死亡減少。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

總之,組培生產(chǎn)中污染的發(fā)生是不可忽視的環(huán)節(jié),在生產(chǎn)過程中思想上要高度重視,行動上要有嚴格遵守操作規(guī)范,才能在一定程度上減輕污染所帶來的危害。