脂蛋白脂酶基因缺陷小鼠急性胰腺炎的研究

趙嚴 程禮 王興鵬 王宇輝 劉國慶

·論著·

脂蛋白脂酶基因缺陷小鼠急性胰腺炎的研究

趙嚴 程禮 王興鵬 王宇輝 劉國慶

目的探討應用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的雜合子小鼠作為制備高脂血癥相關性急性胰腺炎的動物模型的可行性。方法野生型及LPL雜合子小鼠均分為實驗組和對照組，每組又分為12、24 h 2個時點。實驗組腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg體重)7次，每次間隔1 h。對照組同法注射等量生理鹽水。檢測各組小鼠血漿三酰甘油(TG)、淀粉酶水平，觀察胰腺形態(tài)學改變并評分。結果LPL雜合子小鼠對照組血TG為(3.55±0.27)mmol/L，顯著高于野生型小鼠對照組的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。雜合子小鼠實驗組12 h的血TG、淀粉酶水平分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3685±484)U/L，均顯著高于野生型小鼠實驗組12 h的(0.92±0.11)mmol/L和(2501±410)U/L(Plt;0.05)。雜合子小鼠實驗組12 h的胰腺水腫、壞死、出血和炎細胞浸潤的分值分別為3.94±0.21、3.94±0.21、1.84±0.25和1.84±0.25，均顯著高于野生型小鼠實驗組12 h的3.06±0.01、2.52±0.51、0.46±0.22和0.58±0.38(Plt;0.05)。結論LPL雜合子小鼠血TG中度升高且穩(wěn)定，在雨蛙肽誘導下產生嚴重的急性胰腺炎，是研究高脂血癥相關性急性胰腺炎發(fā)病機制的一種理想的動物模型。

胰腺炎； 高酯血癥； 脂蛋白酯酶； 雜合子

高脂血癥相關性急性胰腺炎(LAP)是一種病死率較高的疾病，且復發(fā)率高，并發(fā)癥多，其發(fā)病機制未完全清楚。為闡明相關的發(fā)病機制，常用高脂食餌飼喂方法制備動物模型，但喂養(yǎng)周期長、動物個體差異易導致模型組血脂水平參差不齊等缺點。本文采用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的雜合子小鼠腹腔分次注射雨蛙肽方法制備高脂血癥相關性急性胰腺炎模型，并探討這種新模型形成機制。

材料與方法

一、實驗材料及分組

選用北京大學醫(yī)學部心血管研究所提供的4個月齡、雌性、脂蛋白脂酶(LPL)缺陷的雜合子C57BL6小鼠26只和野生型C57BL6小鼠28只，均分為實驗組和對照組，每組又分為12、24 h 2個時間點。實驗組腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg體重，間隔1 h重復注射，共注射7次。對照組同法注射等量生理鹽水。距首次給藥12、24 h分別于眶靜脈取血，肝素抗凝，離心，取血漿待測。留取胰腺組織標本， 10%甲醛溶液固定。

二、檢測指標

1．血三酰甘油(TG)及淀粉酶檢測：均采用北京中生北控生物技術有限公司提供的ELASA檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作。

2．組織學檢查：固定的胰腺組織常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，由病理科醫(yī)師閱片。參照Schmidt等[1]方法，即從水腫、炎細胞浸潤、實質出血、實質壞死、空泡形成等方面進行雙盲評分。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、血清TG、淀粉酶水平變化

LPL雜合子實驗組12、24 h的血TG 水平分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3.56±0.32)mmol/L，對照組分別為(3.55±0.27)mmol/L和(3.55±0.27)mmol/L；野生型實驗組12、24 h的血TG水平分別為(0.92±0.11)mmol/L和(0.92±0.07)mmol/L，對照組為(0.94±0.18)mmol/L和(0.88±0.15)mmol/L。雜合子實驗組及對照組均顯著高于野生型實驗組及對照組(Plt;0.05)。

LPL雜合子實驗組12、24 h的血淀粉酶水平分別為(3685±484)U/L和(3019±643)U/L，對照組分別為(471±23)U/L和(550±93)U/L；野生型實驗組12、24 h的血淀粉酶水平分別為(2501±410)U/L和(2091±701)U/L，對照組為(358±43)U/L和(386±37)U/L。2個對照組之間無顯著差異；2個實驗組均顯著高于其相應的對照組(Plt;0.05)；雜合子實驗組顯著高于野生型小鼠實驗組(Plt;0.05)。

二、胰腺病理改變

野生型小鼠對照組的胰腺小葉排列整齊，結構完整(圖1A)；實驗組小鼠胰腺組織明顯水腫，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔增寬，腺泡細胞點狀壞死(圖1B)。雜合子小鼠對照組的胰腺部分細胞內出現空泡變性、壞死(圖1C)；實驗組胰腺組織間質明顯水腫，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔增寬，腺泡細胞空泡樣變性、片狀壞死，伴血管充血、血管周圍及間質內炎癥細胞浸潤 (圖1D)。雜合子小鼠對照組胰腺細胞壞死較野生型小鼠對照組明顯；雜合子小鼠實驗組胰腺的水腫、壞死、出血及炎細胞浸潤均較野生型小鼠實驗組顯著(表1，Plt;0.05)。

圖1野生型小鼠對照組(A)、實驗組24 h(B)和雜合子小鼠對照組(C)、實驗組24 h(D)的胰腺病理改變(HE ×200)

表1 各組胰腺組織病理評分

注：與野生型小鼠同組別、同時點比較，aPlt;0.05

討 論

近年來，高三酰甘油血癥已成為急性胰腺炎的發(fā)病原因之一[2]，其發(fā)病機制尚不清楚。而此研究的關鍵首先是建立合理的動物模型。

高脂血癥動物模型主要有先天性、化學物質誘導和轉基因動物3種[3]。由于先天性動物模型來源困難、價格昂貴,實際應用受到限制。化學物質誘導動物模型包括靜脈或腹腔注射化學試劑和采用高脂飼料喂養(yǎng)或通過在食物中加入能促進肝臟合成膽固醇或三酰甘油的物質形成高脂動物模型[4-5]。Takahashi等[6]經股靜脈注射Triton WR 1339誘導SD大鼠高TG血癥。TritoWR1339是一種表面活性劑，它可以抑制卵磷脂膽固醇酰基轉移酶，影響脂蛋白之間的脂質交換和形成脂蛋白復合物，抑制脂質在血液中的清除[7]，使血脂升高。此法簡便、快速，但是不符合人類高脂血癥的形成過程。喂養(yǎng)法形成的高脂動物模型，由于大鼠和小鼠對此類飲食敏感性差，且血漿脂蛋白的合成及清除率與人差異較大，導致模型組血脂水平參差不齊，且喂養(yǎng)時間長，所以很難作為理想的高脂血癥模型。轉基因動物模型通過不表達或過量表達基因來表現各種疾病。涉及脂質代謝的蛋白包括相應的受體、載脂蛋白(Apo)、與脂質代謝有關的酶和轉運蛋白[8]。

北京大學心血管研究所鮑紅梅等[9]與加拿大的合作者一起成功建立了LPL基因敲除C57BL6小鼠。LPL純合子雄性小鼠由于體內缺乏LPL，出生后48 h內即全部死亡。因此，LPL純合子仔鼠于出生12 h內必須用體細胞基因轉移LPL才能成活,該鼠生長至成年表現為極度高的血三酰甘油和自發(fā)性胰腺炎，與人類LPL缺陷一致。

本實驗采用該小鼠與野生型C57BL6小鼠交配后得到的雜合子鼠,具有穩(wěn)定的中度高脂血癥。本組實驗小鼠的血TG為(3.55±0.27)mmol/L，顯著高于野生型小鼠的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。實驗結果顯示，在相同劑量的雨蛙肽誘導下，LPL雜合子小鼠血淀粉酶水平及胰腺的水腫、壞死、出血、炎細胞浸潤均顯著高于野生型小鼠(Plt;0.05)，發(fā)生更嚴重的急性胰腺炎。提示在相同致病因素影響下，LPL雜合子小鼠更易發(fā)生胰腺炎或病變程度加重，可見高TG血癥是促進胰腺炎發(fā)展和增加易感性的因素，而LPL雜合子小鼠也是一個理想的動物模型。

[1] Schmidt J，Lewandrowsi K，Warshaw Al，et al．Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat．Int J pancreatol，1992，l2：41-51．

[2] Yadav D,Pitchumoni CS.Issues in hyperlipidemic pancreatitis.J Clin Gastroenterol,2003,36:54-62.

[3] 倪鴻昌,李俊，金涌,等.大鼠試驗性高脂血癥和高脂血癥性脂肪肝模型研究.中國藥理學通報，2004,20：703-705.

[4] 高瑩，李可基，唐世英,等.幾種高脂血癥動物模型的比較.衛(wèi)生研究，2002,31：97-99.

[5] 張智，閃增郁，向麗華,等.大鼠試驗性高脂血癥兩種造模方法的比較.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2004,2：33-34.

[6] Takahashi Y，lnaba N，Kuwahara S，et al．Effects of gamma terpinene on lipid concentrations in serum using triton WR1339-treated rats. Biosci Biotechnol Bioehem，2003，67：2448-2450．

[7] 倪鴻昌，李俊．高血脂癥實驗性動物模型的研究進展．安徽醫(yī)藥，2004，8：401-403．

[8] 盧笑叢，王有為．血脂類代謝研究中轉基因動物模型．中國比較醫(yī)學雜志，2004，14：133-137.

[9] 鮑紅梅，陳莉，楊菲，等.脂蛋白脂酶基因缺陷的極度高甘油三酯血癥小鼠胰腺炎的研究.中國病理生理雜志，2006，22：1277-1281.

2008-11-06)

(本文編輯：屠振興)

Acutepancreatitisinmicewithlipoproteinlipasedeficiency

ZHAO Yan, CHENG Li, WANG Xing-peng, WANG Yu-hui, LIU Guo-qing.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Medical School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

ObjectiveTo establish an experimental animal model of hypertriglyceridemic (HTG) pancreatitis by using special lipoprotein lipase (LPL) deficient HTG heterozygous mice.MethodsLPL deficient HTG heterozygous mice and wild type mice were divided into experiment group and control group, then each group was subdivided into 12 h,24 h subgroup. Acute pancreatitis (AP) was induced by caerulein intra-abdominal injection for 7 times (50 μg/kg) at the interval of 1 h; the mice in the control group

same amount of normal saline. The serum level of TG, amylase was determined, and morphologic changes were scored.ResultsThe serum level of TG in LPL deficient HTG heterozygous mice was (3.55±0.27)mmol/L, which was significantly higher than that of wild type mice [(0.94±0.18) mmol/L,Plt;0.05]. The serum level of TG and amylase in heterozygous mice at 12 h was (3.55±0.27)mmol/L and (3685±484)U/L, which was significantly higher than those in wild type mice [(0.92±0.11)mmol/L and (2501±410)U/L,Plt;0.05]. The pancreatic tissue edema, necrosis, bleeding and inflammatory cell infiltration score was 3.94±0.21, 3.94±0.21, 1.84±0.25 and 1.84±0.25 in heterozygous mice, which was significantly higher than that of wild type mice (3.06±0.01, 2.52±0.51, 0.46±0.22 and 0.58±0.38,Plt;0.05).ConclusionsThe serum level of TG was moderately and stably elevated in heterozygous mice. The mice developed more severe pancreatitis after caerulein induction, which was an ideal experimental model for study of mechanism of HTG pancreatitis．

Pancreatitis; Hypertriglyceridemia； Lipeprotein lipase； Heterozygote

CorrespongdingauthorWANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com;LIUGuo-qing,Emailgeorgeliu@bjmu．edu．ca

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.017

200080 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院消化科(趙嚴、程禮、王興鵬)；上海同濟大學附屬第十醫(yī)院(王興鵬);北京大學醫(yī)學部心血管研究所(王宇輝、劉國慶)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com；劉國慶，Email：georgeliu@bjmu．edu．ca