波動性葡萄糖對胰島β細胞INS-1的影響

龍可 薛耀明 沙建平 桑丹 林占

波動性葡萄糖對胰島β細胞INS-1的影響

龍可 薛耀明 沙建平 桑丹 林占

目的探討波動性葡萄糖對培養的胰島β細胞株INS-1細胞的損傷機制。方法實驗分5組。對照組:葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；持續高糖組：葡萄糖濃度為16.7 mmol/L；波動性高糖組：16.7 mmo/L葡萄糖培養2 h 后更換葡萄糖濃度為5.5 mmo/L，繼續培養3 h，每天重復3 次,夜間9 h維持在5.5 mmo/L葡萄糖的培養基中；N-乙酰半胱氨酸(NAC，1.0 mmo/L)+高糖組；NAC+波動性高糖組。流式細胞儀檢測活性氧簇(ROS)的水平；四氮唑藍定量檢測細胞內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的活性；同時檢測還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的含量。結果干預72 h后，對照組、高糖組、波動性高糖組、NAC+高糖組和NAC+波動性高糖組細胞的ROS活性分別為37.77±2.31、86.97±7.97、124.27±10.04、60.92±2.61和51.47±3.36；G6PD活性分別為1.25±0.03、1.09±0.02、1.03±0.01、1.12±0.02和1.21±0.01；NADPH含量分別為(0.123±0.003)mmol/mg prot、(0.112±0.004)mmol/mg prot、(0.099±0.002)mmol/mg prot、(0.116±0.005)mmol/mg prot和(0.120±0.002)mmol/mg prot。波動性高糖組細胞ROS活性較單純高糖組顯著增加(Plt;0.01)，G6PD活性和NADPH含量較單純高糖組顯著減少(Plt;0.01)；加NAC共孵育使細胞的變化程度減小。結論波動性高濃度葡萄糖使培養的INS-1細胞氧化應激水平增高，其機制可能是由于抗氧化酶G6PD活性降低導致了氧化還原的失衡。

胰腺β細胞； 活性氧； 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶； 波動性高糖

隨著人們對糖尿病發病機制研究的不斷深入,高糖引起的氧化應激在糖尿病發生發展中的作用備受關注[1]。與其他組織細胞相比,胰島細胞內抗氧化物酶水平較低[2]，這使其更容易受到氧化應激攻擊。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)是細胞內關鍵的抗氧化酶，它通過調節還原型輔酶Ⅱ(NADPH)來維持細胞內抗氧化物質水平，協調細胞內氧化還原的平衡。而氧化應激歸根結底即細胞內活性氧簇(ROS)的產生增多和(或)抗氧化酶的減少。最近研究表明,血糖波動比持續高血糖對糖尿病并發癥危害可能更嚴重。本實驗通過波動性葡萄糖處理培養的胰島β細胞,觀察波動性葡萄糖對β細胞的影響，探討其機制。

材料和方法

一、實驗分組及處理

大鼠胰島細胞瘤細胞株INS-1購自武漢大學細胞庫，置RPM I1640的完全培養基(含10 mmol/L Hepes,1 mmol/L 丙酮酸鈉,50 μmol/L β-巰基乙醇,100 U/ml青霉素和100 μg/ml的鏈霉素)常規培養，消化收集細胞，調整細胞濃度至1×106/ml。6孔培養板中每孔加入1 ml細胞懸液，分5個實驗組。對照組：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；持續高糖組：葡萄糖濃度為16.7 mmol/L；波動性高糖組：16.7 mmo/L葡萄糖培養2 h后更換葡萄糖濃度為5.5 mmo/L，繼續培養3 h，每天重復3 次,夜間9 h維持在5.5 mmo/L葡萄糖培養基中[3]；N-乙酰半胱氨酸(NAC，1.0 mmo/L)+高糖組；NAC+波動性高糖組。每組設3個復孔，共干預72 h。

二、檢測指標

1．ROS測定：采用熒光探針DCFH-DA測定法。按照ROS檢測試劑盒說明書操作。取1 ml細胞懸液(gt;104)上流式細胞儀檢測，激發波長488 nm，發射波長525 nm，計算平均熒光強度(MFI)。

2．G6PD活性檢測：取1 ml細胞懸液(gt;106)至凍存管中，置液氮冷凍后37℃水浴融化，重復3次，每次間隔10 min。最后將液體轉移至1.5 ml EP管，4℃ 12 000 g離心5 min，取上清，采用四氮唑藍定量測定法檢測G6PD活性。

3．NADPH含量測定：按照文獻[4]的方法檢測，單位為mmol/mg prot。

三、統計學方法

結 果

一、細胞內ROS的變化

對照組、高糖組、波動性高糖組、NAC+高糖組和NAC+波動性高糖組細胞的ROS分別為37.77±2.31、86.97±7.97、124.27±10.04、60.92±2.61和51.47±3.36，高糖組和波動性高糖組均較對照組明顯增高(Plt;0.01)，同時波動性高糖組又顯著高于高糖組(Plt;0.01)。NAC+波動性高糖組較單純波動性高糖組顯著減少(Plt;0.01)，但仍高于對照組(Plt;0.01，圖1)。

圖1 各組INS-1細胞內ROS的熒光強度圖

二、G6PD和NADPH的變化

對照組、高糖組、波動性高糖組、NAC+高糖組和NAC+波動性高糖組細胞的G6PD活性分別為1.25±0.03、1.09±0.02、1.03±0.01、1.12±0.02和1.21±0.01；NADPH含量分別為(0.123±0.003)mmol/mg prot、(0.112±0.004)mmol/mg prot、(0.099±0.002)mmol/mg prot、(0.116±0.005)mmol/mg prot和(0.120±0.002)mmol/mg prot。高糖組和波動性高糖組G6PD及NADPH含量明顯低于對照組(Plt;0.01)，波動性高糖組又低于高糖組(Plt;0.01)，而NAC+波動性高糖組較單純波動性高糖組顯著增加(Plt;0.01)。

討 論

長期高糖引起的氧化應激可對多種細胞造成損傷。越來越多的證據表明,糖尿病引起的氧化應激是導致糖尿病及其并發癥的最根本原因。氧化應激的重要指標之一是ROS的大量增多。ROS是在體內有氧代謝過程中產生的，是由氧激發的化學性質十分活潑的分子,包括氧自由基和非自由基的含氧產物。過量的ROS會打破機體正常氧化、還原動態平衡，造成生物大分子的氧化損傷，干擾正常生命活動，即處于氧化應激狀態[5]。

高血糖主要有兩種形式，即持續性高血糖和波動性高血糖[4]。目前許多研究都開始關注血糖波動對細胞的影響[6]。然而血糖波動對胰島β細胞毒害的研究，目前國內外研究較少。本實驗結果顯示，與正常對照組相比，波動高濃度葡萄糖組和高糖組細胞較對照組細胞產生更多的ROS，提示波動高糖和高糖均可引起細胞氧化應激的損傷，而且前者的損傷更甚。

氧化應激的出現更準確地說是由于細胞內氧化、抗氧化酶水平的失調。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化應激引起胰島β細胞損傷是糖尿病發生、發展的一個重要機制[7]。與其他組織細胞相比,胰島細胞內抗氧化物酶水平較低[2]，因而,在一些因素的誘導下,更容易發生氧化應激反應。葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PD)是細胞內關鍵的抗氧化酶。它通過調節細胞內主要的還原當量NADPH含量，對抗氧化應激造成的損傷，并且延緩細胞的衰老[8]，因此其重要性越來越受到研究者的關注。Pandolfi等[9]通過敲除細胞G6PD基因的實驗證實，G6PD敲除的細胞與內源性G6PD水平正常的細胞相比，其對氧化應激更加敏感、存活率及克隆效率降低。本實驗顯示，高糖組和波動性高糖組INS-1細胞內G6PD的活性較對照組明顯下降，同時ROS增多，且波動性高糖組的變化更為顯著。提示波動的葡萄糖可能通過影響細胞內抗氧化酶G6PD的活性，導致ROS的增多，從而加速細胞氧化應激的損傷。

NAC是抗氧化劑，本實驗在高糖刺激INS-1細胞的同時加用NAC，結果細胞產生的ROS量顯著減少，G6PD活性和NADPH含量明顯增加，提示使用抗氧化劑干預，對β細胞的損傷可起到一定的保護作用。因此在臨床控制血糖的方面，除控制代謝紊亂,降低高血糖外,更應該堅持平穩降糖措施。

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[2] Tanaka Y,Tran PO,Harmon J,et al.A role for glutathione peroxidase inprotecting pancreatic beta cells against oxidative stress in a model of glucose toxicity.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:12363-12368.

[3] Polhill TS,Saad S,Poronnik P,et al.Short-term peaks in glucose promote renal fibrogenesis independently of total glucose exposure.Am J Physiol Renal Physiol,2004，287:F268-273.

[4] Prato SD.Inserch of normoglycemia in diabetes:controlling postprandial glucose.Int J Obesity,2002,26(Suppl 3):S9217.

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[6] Piconi L,Quagliaro L,Da Ros R,et al.Intermittent high glucose enhances ICAM-1,VCAM21,E-selectin and interleukin-6 expression in human umbilical endothelial cells in culture：the role of poly (ADP-ribose) polymerase.J Thromb Haemost,2004,2:1453-1459.

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[8] Chandrasena LG,De Silva LD,De Silva KI,et al.Changes in erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and reduced glutathione (GSH) activities in the development of senile and diabetic cataracts.Southeast Asian J Trop Med Public Health,2008,39:731-736.

[9] Pandolfi PP,Sonati F,Rivi R,et al.Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD):G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.EMBO J,1995,14:5209-5215.

2008-10-23)

(本文編輯：呂芳萍)

Effectoffluctuanthighglucosetopancreaticβ-CelllinesINS-1

LONGKe,XUEYao-ming,SHAJian-ping,SONGDan,LINZhan.

DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

XUEYao-ming,Email:yaomingnf@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the damage mechanism of fluctuant high glucose on the INS-1 cells (pancreatic β-cell lines).MethodsThe cells were divided into five groups: the control groups (A group: 5.5 mmol/L of glucose), the continuing high glucose group (B group:16.7 mmol/L of glucose), the fluctuant glucose group (C group: 16.7 mmol/L of glucose for cultivation for 2 h, then the concentration changed to 5.5 mmol/L for cultivation for 3 h, which was repeated 3 times per day; the cells were kept in the medium containing 5.5 mmol/L of glucose during night time for 9 h), the continuing high glucose plus NAC (1.0 mmo/L) group (D group), the fluctuant glucose plus NAC group (E group). The intracellular reactive oxygen species (ROS) was observed by the flow cytometry. The activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) was estimated by the tetrazolium linked cytochemical method.Results72 h after intervention, the levels of ROS were 37.77± 2.31, 86.97±7.97, 124.27±10.04, 60.92±2.61 and 51.47±3.36, respectively, in A～E group; the activities of G6PD were 1.25±0.03, 1.09±0.02, 1.03±0.01, 1.12±0.02 and 1.21± 0.01, respectively; the levels of NADPH were (0.123±0.003)mmol/mg prot, (0.112±0.004)mmol/mg prot, (0.099±0.002)mmol/mg prot, (0.116±0.005)mmol/mg prot and (0.120±0.002)mmol/mg prot, respectively. The level of ROS in the cells of the fluctuant glucose group were significantly higher than that in the continuing high glucose group (Plt;0.01). The G6PD activity and NADPH was significantly lower in fluctuant high glucose group than those in the continuing high glucose group (Plt; 0.01). NAC co-cultivation decreased the extent of cell′s change.ConclusionsExposure of INS-1 to high glucose lead to increased oxidative stress, possible mechanism included decreased G6PD activity and subsequent imbalance between oxidation and reduction.

Insulin-secreting cells; Reactive oxygen species; Glucose-6-phosphate dehydrogenase; Fluctuanting high glucose

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.014

510515 廣州，南方醫科大學南方醫院內分泌代謝科

薛耀明，Email: yaomingnf@yahoo.com