UCA1在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義

[摘要] 目的 探討UCA1 mRNA在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與病理分級(jí)、臨床分期和復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法 采用SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法檢測(cè)39例膀胱癌組織及8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 39例膀胱癌組織中UCA1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性39例，陽(yáng)性率分別為100%;8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性3例，陽(yáng)性率分別為37.5%;UCA1 mRNA的表達(dá)在癌組織和正常組織中的陽(yáng)性率比較差異有顯著性(P<0.05);UCA 1mRNA的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期和復(fù)發(fā)關(guān)系密切(P<0.05)。結(jié)論 UCA1參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)膀胱癌的診斷、判斷病理分級(jí)、臨床分期和預(yù)后具有重要臨床意義。

[關(guān)鍵詞] UCA1;膀胱癌;實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);SYBR GreenⅡ

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.14 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)04-16-03

UCA1 Expression in Bladder Cancer and Its Clinical Significance

WANG BaosenXING JinchunZHENG Jiaxin

Department of Urology，the Affiliated Xiamen First Hospital of Fujian Medical University，Xiamen 361003，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of UCA1 mRNA in bladder transitional cell carcinoma and its relationship with pathological grade，clinical stage and recurrence. Methods The SYBR Green II real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to evaluate the UCA1 mRNA expression in 39 cases of bladder transitional cell carcinoma and 8 cases of normal tissue. Results All of 39 cases of bladder transitional cell carcinoma cases showed the positive expression of UCA1 mRNA，with the positive rate of 100%，and 3 of 8 cases of normal tissue showed the positive expression of UCA1 mRNA，with the positive rate of 37.5%. There was a significant difference in the positive rate of between the two(P<0.05). There was a close relation between the pathological grade(P<0.05)， the clinical stage(P<0.05)and recurrence(P<0.05). Conclusion UCA1 is involved in the development and progression of bladder transitional cell carcinoma and it is of important clinical significance in the diagnosis of bladder transitional cell carcinoma and the judgement of pathological grade，clinical stage and prognosis.

[Key words] UCA1;Bladder cancer;Real time quantitative RT-PCR;SYBR Green Ⅱ

UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的膀胱癌的特異性非編碼基因，本文運(yùn)用SYBR GreenⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)39例膀胱癌組織及9例膀胱正常組織中UCA1 mRNA，探討其表達(dá)與膀胱癌臨床分期和病理分級(jí)的關(guān)系，進(jìn)一步為膀胱的診斷、治療和預(yù)后提供臨床依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

選取我院2008年10月～2009年9月術(shù)后病理證實(shí)為膀胱癌的膀胱癌標(biāo)本39份，其中膀胱腫瘤電切的標(biāo)本31份，行全膀胱手術(shù)的腫瘤標(biāo)本8份，初發(fā)28例，復(fù)發(fā)11例。所有膀胱癌患者中男32例，女7例。年齡(60.72±13.19)歲。根據(jù)腫瘤浸潤(rùn)深度可分為表淺型(Tis、Ta、T1)和浸潤(rùn)型，其中表淺型26例，浸潤(rùn)型13例。病理情況根據(jù)WHO/ISUP分級(jí)法，其中高級(jí)別尿路上皮癌9例，低級(jí)別尿路上皮癌(包括低度惡性?xún)A向尿路上皮乳頭瘤)30例;膀胱正常組織8份，其中1份前列腺增生患者正常膀胱組織，其余7份為膀胱腫瘤邊緣3cm以外的正常膀胱組織，其中男6份，女2份，年齡(63.75±12.45)歲。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后立即取材放入RNA保存液然后保存于-70oC低溫冰箱中保存。

1.2試劑和儀器

總RNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN，廈門(mén)泰京生物技術(shù)公司)，PrimeScript TMRT reagent kit and SYBR○R Premix Ex Taq TMII(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)，低溫離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)、UV-2450分光分度儀(日本島津公司)、Bio-Rad Thermal Cycler(美國(guó)伯樂(lè)公司)、Roche Light Cycler480 熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)等。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取及濃度測(cè)定使用離心柱型總RNA 提取試劑盒，得到35μL 總RNA，然后取5μL稀釋20倍后用UV-2450分光分度儀進(jìn)行純度(OD260/OD280)和濃度[(OD260 -0.024)*20]測(cè)定。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄cDNA使用 PrimeScript TMRT reagent kit試劑盒，10μL反應(yīng)體系包括6xPrimeScript TM buffer 2μL，Random 6mers(100uM)0.5μL、PrimeScript TMRT Enzyme 0.5μL、Oligo dT primer 0.5μL、加入總RNA 500ng/(RNA濃度)，加RNase Free dH2O至10μL，反應(yīng)條件37oC 15min，85℃ 5sec， 最后降至4℃，逆轉(zhuǎn)錄完成后加dH2O 40μL將其稀釋5倍-20℃保存。

1.3.3實(shí)時(shí)PCR運(yùn)用NCBI Primer Design Tool 設(shè)計(jì)引物，UCA1 Forward primer GCTTAGGCTGGCAACCATCA，Reverse primer AAGCTGAGGCTGGCAAAGAG;GAPDH Forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse primer GAAGATGGTGGG ATTTC，分別擴(kuò)增190bp和226bp片段長(zhǎng)度，引物送Ivitrogen公司合成。運(yùn)用SYBR GREEN II real time PCR 法，反應(yīng)條件:10μL反應(yīng)體系中含有SYBR○RPremix Ex TaqTM Ⅱ 5μL，PCR Forward Primer和 PCR Reverse Primer 各0.4μL，dH2O 3.2μL，DNA 模板1μL，擴(kuò)增條件95℃ 5sec，60℃ 15sec， 72℃ 15sec，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)條件95℃ 5sec、4.4℃/s， 65℃ 1min、2.2℃/s。

1.4結(jié)果判定

Roche Light Cycler480熒光定量PCR儀檢測(cè)結(jié)果由Light Cycler軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，相對(duì)定量采用比較Cp值法，即以目的基因UCA1 mRNA Cp值和內(nèi)參基因GAPDH mRNA Cp值的比值R作為評(píng)價(jià)表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)分析熔解曲線(xiàn)來(lái)判斷PCR產(chǎn)物特異性，擴(kuò)增出了單一產(chǎn)物，未出現(xiàn)其他異常波形，波的形狀銳利，說(shuō)明反應(yīng)特異性好。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間陽(yáng)性率的比較用χ2檢驗(yàn);偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(M)及四分位間距(QR)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1FQ-RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

見(jiàn)圖1。S型曲線(xiàn)表示有mRNA擴(kuò)增，陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照在45個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)均未出現(xiàn)S型曲線(xiàn)屬正常結(jié)果，其擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性通過(guò)熔解曲線(xiàn)判定見(jiàn)圖2。UCA1和內(nèi)參GAPDH兩對(duì)引物在同一體系中均擴(kuò)增出了單一產(chǎn)物，未出現(xiàn)其他異常波形，波峰形狀銳利，說(shuō)明反應(yīng)特異性好。8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA陽(yáng)性表達(dá)3例，陽(yáng)性率37.5%;39例膀胱癌組織中UCA1 mRNA陽(yáng)性率100%，正常組織和癌組織UCA1 mRNA陽(yáng)性率比較用χ2檢驗(yàn)，χ2=21.10，P<0.05，兩者比較有顯著性差異，說(shuō)明UCA1可作為膀胱癌診斷的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)膀胱癌的診斷具有重要的意義。

2.2UCA1 mRNA在39例不同分級(jí)、分期及初發(fā)和復(fù)發(fā)膀胱癌組織的表達(dá)情況

見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，其在不同病理分級(jí)、分期及其在初發(fā)和復(fù)發(fā)癌組織的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UCA1對(duì)膀胱癌進(jìn)展程度判斷的具有重要意義，其可能通過(guò)某種機(jī)制對(duì)膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。

3討論

膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在泌尿系腫瘤中位居第1位[1]，其主要的病理類(lèi)型是膀胱移行細(xì)胞癌，約占90%以上，其發(fā)生、發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果。目前對(duì)于膀胱癌的診斷除了CT和MRI以及膀胱鏡檢查外尚缺乏一個(gè)理想的分子標(biāo)志物，但是CT和MRI的診斷率較低，而膀胱鏡檢查敏感性低且為有創(chuàng)檢查，易增加尿路感染的機(jī)會(huì)，其特異性也易受標(biāo)本收集和尿路感染等影響。在大多數(shù)情況下以淺表性膀胱移行細(xì)胞癌出現(xiàn)，雖然它可以很容易的通過(guò)膀胱腫瘤電切手術(shù)切除，但膀胱癌具有復(fù)發(fā)率較高的特點(diǎn)，且復(fù)發(fā)后腫瘤惡性度增高，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等惡性行為有所增強(qiáng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道5年復(fù)發(fā)率超過(guò)60%，15年的復(fù)發(fā)率超過(guò)80%，而在這些復(fù)發(fā)的膀胱癌患者中，約10%～30%進(jìn)展為浸潤(rùn)性膀胱癌[2-3]。目前雖然有許多潛在的生物標(biāo)記物可以用來(lái)判斷膀胱癌的進(jìn)展和預(yù)后，但是迄今沒(méi)有一個(gè)可靠的分子標(biāo)記物可以用來(lái)檢測(cè)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)以降低病人的死亡率[4]。

近年來(lái)，許多研究突出強(qiáng)調(diào)了長(zhǎng)片段(400bp)非編碼RNA在腫瘤形成過(guò)程中起重要作用，暗示其可以被用來(lái)作為腫瘤標(biāo)志物[5-6]。目前關(guān)于非編碼RNA在膀胱腫瘤中研究卻相對(duì)較少，王凡等[7]運(yùn)用抑制性雜交消減技術(shù)從膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株BLZ -211和BLS-211中分離出一個(gè)新的表達(dá)序列表簽(基因序列號(hào)DR159656)，UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是基于該已表達(dá)序列表簽從BLZ-211細(xì)胞基因序列中克隆鑒別出的一個(gè)非編碼RNA，亦為一個(gè)膀胱癌特異性基因，通常高表達(dá)于胚胎組織、大多數(shù)胎兒組織和膀胱癌組織中，但在胎兒出生后，UCA1表達(dá)開(kāi)始逐漸降低至消失，在成人僅高表達(dá)于膀胱癌組織，UCA1這種基因表達(dá)形式的時(shí)間性和空間性類(lèi)似于ncRNA H19[8]，暗示它是一個(gè)癌胚基因;在BLS-211細(xì)胞株的研究中，UCA1基因的外源性表達(dá)提示它具有致瘤性、侵襲潛能并與藥物耐藥性有關(guān)，在膀胱癌的浸潤(rùn)和進(jìn)展過(guò)程中起一定的作用。UCA1具有較好的穩(wěn)定性，并且很少受到腫瘤遺傳異質(zhì)性的影響，在正常組織、泌尿系其他疾病如前列腺增生癥、腺性膀胱炎等和其他類(lèi)型腫瘤尤其是腎臟腫瘤中均低表達(dá)，使其在膀胱移行細(xì)胞癌患者與正常人和其他的泌尿系腫瘤的鑒別中具有重要意義[9]。本研究通過(guò)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)UCA1 mRNA 在膀胱癌患者癌組織和正常組織中表達(dá)情況，證實(shí)UCA1 mRNA在膀胱癌組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率高達(dá)100%，在正常膀胱組織中低表達(dá)，陽(yáng)性率37.5%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其表達(dá)含量在不同臨床分期、臨床分級(jí)、初次和復(fù)發(fā)之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用定量的方法進(jìn)一步證實(shí)UCA1在膀胱癌的診斷以及判斷進(jìn)展和預(yù)后情況方面具有重要意義，可為臨床治療提供重要依據(jù)。

至今UCA1在胚胎形成中的作用以及在膀胱癌發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不明確，它在膀胱癌治療方面能否成為基因靶向治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhang W，Xiang YB，Liu ZW，et al. Trends analysis of common urologic neoplasm incidence of elderly people in Shanghai[J]. Ai Zheng，1999，23:555-558.

[2] Kamat AM， Lamm DL. Chemoprevention of urologic cancer[J]. JUrol，1999，161:1748-1760.

[3] Sugano K，Kakizoe T. Genetic alterations in bladder cancer and their clinical applications in molecular tumor staging[J]. NatClinPract Urol，2006，3:642-652.

[4] Barocas DA，Clark PE. Bladder cancer[J]. Curr Opin Oncol，2008，20:307-314.

[5] Panzitt K，Tschernatsch MM，Guelly C，et al. Characterization of HULC，a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma，as noncoding RNA[J]. Gastroenterology，2007，132:330-342.

[6] Petrovics G，Zhang W，Makarem M，et al. Elevated expression of PCGEM1，a prostate specific gene with cell growth-promoting function， is associated with high-risk prostate cancer patients[J]. Oncogene，2004，23:605-611.

[7] F Wang， Li X， Xie XJ， etal. UCA1，a non-protein-coding RNA up-regulated in bladder carcinoma and embryo，influencing cell growth and promoting invasion[J]. FEBS Letters， 2008， 582:1919- 1927.

[8] LooijengaLH，Verkerk AJ，De Groot N，et al. H19 in normal development and neoplasia[J]. Mol ReprodDev，1997，46:419-439.

[9] Wang XS，Zhang Z，Wang HC，et al. Rapid Identification of UCA1 as a very sensitive and specific unique marker for human bladder carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2006，12(16):4851-4858.

(收稿日期:2009-11-02)