酶聯(lián)免疫吸附法檢測雞肉中林可霉素

摘要:通過對林可霉素分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，制備了半抗原及人工抗原免疫動物，制備了林可霉素的單克隆抗體。該方法的靈敏度為0.2μg/L，對林可霉素的交叉反應(yīng)率為100%，對克林霉素、紅霉素、泰樂菌素、鏈霉素、卡那霉素的交叉反應(yīng)率均小于1%，以20μg/kg和40μg/kg添加水平的雞肉樣本回收率范圍為83.5%～96.5%，變異系數(shù)小于15%，表明該方法快速、靈敏、可靠，適合用于檢測雞肉中的林可霉素殘留限量檢測的要求。

關(guān)鍵詞:酶聯(lián)免疫技術(shù);林可霉素;雞

中圖分類號:TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1007-273X(2010)03-0007-03

林可霉素(lincomycin)又稱潔霉素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，有較強(qiáng)的抑菌活性，其結(jié)構(gòu)式如圖1:

林可霉素殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國都對其作出限量要求，中國農(nóng)業(yè)部235號文件規(guī)定其殘留限量為0.01mg/kg(雞肉)，日本規(guī)定其殘留限量為0.02mg/kg(雞可食用內(nèi)臟)。

林可霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜技術(shù)[1，2]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[3]、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)[4-6]、氮磷氣相色譜檢測法[7]、薄層色譜[8]、氣相色譜[9]等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查，本文的目的就是建立一種快速靈敏地檢測雞肉中林可霉素殘留的酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)。

1材料與方法

1.1試劑與藥品

林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品:購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、辣根過氧化物酶(HRP):購自Sigma公司;其他常規(guī)試劑，除特別注明外均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2主要儀器

酶標(biāo)儀:雷伯MK3(芬蘭);酶標(biāo)板:Costar公司產(chǎn)品;離心機(jī)TDL-40B:上海安亭。

1.3實(shí)驗(yàn)動物

8周齡的雌性Balb/C小鼠，共6只。

1.4林可霉素半抗原、完全抗原的合成及單克隆抗體的制備

1.4.1林可霉素半抗原合成將林可霉素通過琥珀酸酐法合成林可霉素-琥珀酸酐半抗原，具體步驟如下:稱取2.3g林可霉素和0.5g琥珀酸酐放入50mL圓底燒瓶中加無水吡啶至完全溶解，70℃加熱攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾去溶劑，殘余物用丙酮洗滌數(shù)次，用乙酸乙酯-正己烷使其結(jié)晶，得半抗原林可霉素-琥珀酸酐。具體合成技術(shù)路線如圖2。

1.4.2林可霉素免疫原及包被原的合成將林可霉素半抗原分別與牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法偶聯(lián)，得到林可霉素免疫原與包被原。

1.4.3動物免疫及單克隆抗體的制備用200μg的林可霉素免疫原與等量FCA混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射。二免和三免時，將FCA換成FIA，劑量和方法同上，每次免疫間隔時間為2周，三免后第7天，小鼠尾部靜脈采血，室溫靜置1h，4℃過夜，12 000r/min離心10min，收集血清，4℃保存，用間接ELISA法測定血清效價，待效價較高時，按照150mg/只的劑量腹腔注射加強(qiáng)免疫。3d后取小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規(guī)方法制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用。

1.5酶聯(lián)免疫方法的建立

1.5.1采用方陣滴定法確定包被抗原與抗體的最佳工作濃度每孔加入100mL最佳工作濃度的包被抗原包被酶標(biāo)板，37℃溫育2h。洗滌液洗滌，用封閉液37℃條件下封閉2h，洗滌，干燥備用。向包被有包被抗原的酶標(biāo)板微孔中加入林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或雞肉樣品溶液50mL，再加入林可霉素單克隆抗體溶液50mL，用蓋板膜封板，25℃反應(yīng)30min，洗滌液洗滌4~5次拍干。再加入100mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體溶液，25℃反應(yīng)30min，重復(fù)洗板，每孔再加入100mL TMB系統(tǒng)底物液，25℃顯色15min，每孔加入50mL 2mol/L硫酸，在酶標(biāo)儀測定450nm處各孔OD值。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以1.5.1步驟所測獲得的林可霉素的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值，以林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)的半對數(shù)值(lgC)為x軸，百分吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.5.3檢測單克隆抗體與其他同類藥物的交叉反應(yīng)率測定方法同1.5.1，但抑制物分別為倍比濃度的克林霉素、紅霉素、泰樂菌素、鏈霉素、卡那霉素，根據(jù)抑制曲線計算抑制抗原抗體結(jié)合50%時的各競爭物的濃度之比。計算公式如下:

交叉反應(yīng)率(%)=(引起50%抑制林可霉素的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)×100%

1.6樣品前處理

稱取2.0g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL甲醇-鹽酸溶液，振蕩5min，4 000r/min離心5min，移取200mL上清液復(fù)溶于600mL PBS中混勻，取50mL用于分析。

1.7最低檢測限、回收率及精密度

取20份空白樣品。按照前述步驟處理后所建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對應(yīng)的濃度。以20份空白樣品對應(yīng)的樣品濃度平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本檢測的最低檢測限[10];另取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別對雞肉樣品按照20μg/kg、40μg/kg進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。每個濃度做4個重復(fù)，計算準(zhǔn)確度及精密度。

2結(jié)果與分析

2.1ELISA方法的建立

標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，見圖3，該單克隆抗體對其類似物的交叉反應(yīng)性見表1。從表中可以看出，該單克隆抗體對其他幾種類似物的交叉反應(yīng)率均較低，其對林可霉素具有較好的特異性。

2.2最低檢測限

對空白雞肉樣本進(jìn)行20次檢測，測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為試劑盒的實(shí)際樣本的最低檢測限，結(jié)果見表2。

2.3準(zhǔn)確度與精密度

ELSIA法的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)來表示。

2.3.1樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)取雞肉樣本添加林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品至20μg/kg、40μg/kg，分別對樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個濃度做4個重復(fù)，分別計算準(zhǔn)確度，檢測結(jié)果見表3。

以20μg/kg、40μg/kg添加林可霉素的雞肉為樣本，其回收率范圍為83.5%~96.5%，變異系數(shù)小于15%。

2.3.2精密度取雞肉樣本添加林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品至20μg/kg、40μg/kg，每個濃度重復(fù)4次，分別計算變異系數(shù)(CV)，結(jié)果見表4。

3結(jié)論

本研究制備了林可霉素單克隆抗體，初步建立了林可霉素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測方法。結(jié)果表明，該方法的靈敏度為0.2μg/L，對雞肉樣本最低檢測限為9.9μg/kg，以20μg/kg、40μg/kg添加水平的雞肉樣本，回收率范圍為83.5%～96.5%，變異系數(shù)小于15%。運(yùn)用酶聯(lián)免疫方法對雞肉中林可霉素殘留量進(jìn)行篩選，樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少，檢測成本低，是林可霉素藥物殘留檢測發(fā)展趨勢。

參考文獻(xiàn):

[1]錢紅薈，曹敏，高效液相色譜法同時檢測鹽酸林可霉素和硝酸咪康唑[J].海峽藥學(xué)，2008(4):36-38.

[2]MOATS W A. Determination of lincomycin in milk and tissues by Reversed-phase liquid chromatography[J].J. Agric. Food Chem，1991，39:1812-1816.

[3]岳振峰，陳小霞，謝麗琪，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物組織中林可酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留[J].分析化學(xué)，2007，35(9):1290-1294.

[4]THOMPSON T S，NOOT D K，CALVERT J，et al. Determination of lincomycin and tylosin residues in honey using solid-phase extraction and liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2003， 1020:241-250.

[5]GB/T 22941-2008，蜂蜜中林可霉素 紅霉素 螺旋霉素 替米考星 泰樂霉素 交沙霉素 吉他霉素 竹桃霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[G].

[6]SIN D W，WONG Y C，IP A C. Quantitative analysis of lincomycin in animal tissues and bovine milk by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2004， 34(3):651-659.

[7]LUO W，YIN B，ANG C Y，et al. Determination of lincomycin residues in salmon tissues by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications，1996，687(2):405-411.

[8]王鑫芳，劉穎，李明江，等.用薄層色譜法檢測林可霉素B組分[J].中國生化藥物雜志，2006，27(6):371-371，382.

[9]陶燕飛，于 剛，陳冬梅，等.動物可食性組織中林可霉素和大觀霉素殘留檢測方法——?dú)庀嗌V法[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2008，10(S2):63-68.

[10]DEGAND G，DUYCKAERTS A B，ROGISTER G M. Determination of clenbuterol in bovine tissues and urine by enzyme immunoassay[J]. Journal of Agricultrual. Food Chemistry，1992，40:70-75.