豬PBD-1穩定轉染細胞系的建立

摘要:目的:構建穩定表達豬PBD-1的轉基因細胞系，為穩定生產豬PBD-1并將其應用于新型獸藥的開發提供生產細胞源。方法:真核表達載體pIRES2-EGFP-PBD-1經酶切和測序鑒定后，用脂質體介導法轉染marc-145細胞，通過不同濃度的G418加壓篩選，和進一步采用單個克隆法篩選，建立穩定轉染的marc-145細胞系，用RT-PCR及抑菌試驗檢測PBD-1的表達。結果:建立了穩定轉染的marc-145細胞系，成功地表達目的基因，其培養上清液及細胞凍融液具有抑菌作用。結論:利用真核表達載體pIRES2-EGFP-PBD-1穩定轉染marc-145細胞系，為進一步研究豬PBD-1的生物學特性及其在獸用生物制品上的應用奠定了基礎。

關鍵詞:豬β防御素l;真核表達載體;marc-145細胞;穩定轉染

中圖分類號:S858.28文獻標識碼:A文章編號:1007-273X(2010)04-0008-03

傳統抗生素的廣泛使用導致耐藥菌株大量產生，特別是多重耐藥菌的出現給感染性疾病的治療帶來了許多新的問題，因此尋找和開發無耐藥性的新型抗菌藥物對于畜牧業具有非常重要的現實意義[1]。近年來在生物體內發現的防御素類物質就具有這種特殊的抗菌活性，Ganz等[2]將其命名為防御素

(Defensins)。豬的β防御素l(porcine β defensin 1，PBD-1)廣泛分布于肝、呼吸道、胸腺、脾臟、臍帶等多種組織細胞內，在豬防御系統中有重要作用，既可用作畜禽飼料添加劑，也可用于食品保鮮劑，還可開發成新的廣譜抗菌藥物[3]，因此豬防御素的成功獲取能帶來極大的社會、經濟效益。但是，豬體內天然防御素表達量低、分子小，分離困難，化學合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術重組表達外源基因已成為獲取目標蛋白的有效途徑之一[3-7]。本研究將豬PBD-1真核表達載體穩定轉染marc-145細胞，通過單克隆篩選，建立了穩定的轉基因細胞系，為進一步研究豬PBD-1的生物學特性及其在獸用生物制品上的應用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑

轉染試劑Lipofectamine 2000和篩選試劑G418均由Invitrogen公司生產;DMEM高糖培養基、胎牛血清由Gibco公司生產;胰蛋白酶、PBS等為國產。限制性內切酶EcoRI、BamH I、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit均購自華美生物工程公司;RNeasy Mini RNA 提取試劑盒由Qiagen(德國)公司生產;蛋白胨和酵母浸提液來自Oxoid公司;引物由上海生物工程公司合成。

1.2菌種、質粒和細胞

大腸桿菌DH5α為本室保存，質粒pMD18-T 由TaKaRa公司提供。質粒載體pIRES2-EGFP-PBD-1由本實驗室構建[8]。marc-145細胞購自武漢中博生物股份有限公司，在本實驗室傳代保存。

1.3建立穩定轉染豬PBD-1的marc-145細胞系

將復蘇后傳代3次的marc-145細胞以胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基調成5×105個/mL的密度，接種于若干個直徑為35mm的培養皿中，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24h，待細胞融合至70%～80%時，按照Lipofectamine 2000操作說明書進行細胞轉染操作，對照組不加脂質體。6h后更換有血清、無雙抗的高糖DMEM培養基繼續培養。轉染48h后，開始用G418篩選。過程為:頭3d 1 000μg/mL，接著用2 000μg/mL的濃度繼續篩選，直至絕大部分細胞死亡，將G418濃度改為1 000μg/mL維持篩選6周。將獲得細胞采用極限稀釋法傳至96孔細胞培養板，每孔大約1個細胞，交替使用常規培養基和G418(1 000μg/mL)培養基培養單個細胞，至其長出單個克隆。在熒光顯微鏡下挑選出最優的細胞克隆繼續培養，并不斷擴繁至建立新的細胞系。

1.4RT-PCR檢測目的基因PBD-1

收集空質粒轉染細胞以及PBD-1轉染細胞， 按RNeasy Mini RNA說明書抽提細胞總RNA。將DU640核酸蛋白測定儀測定濃度RNA稀釋至1μg/μL。cDNA第一鏈的合成的反應體系是50μL，將已稀釋RNA各取2μL(含RNA2μg)于滅菌的Ep管中，加入10μmol/L的oligod(T)11.5μL，加DEPC處理H2O至總體積15μL。混勻稍微離心，于70℃溫育5min以解除RNA的二級結構，立即置于冰上防止二級結構的重新生成。然后加入35μL的其他組分，包括:M-MLV逆轉錄酶(40U)1μL，5×RT緩沖液10μL，dNTP(10mmol/L)2.5μL，RNAase抑制劑(40U)1μL和DEPC處理H2O 20.5μL，混勻離心， 置37℃溫育1h，95℃，5min滅活。反轉錄的cDNA 于-20℃保存。以GAPDH為內參進行PCR反應。在25μL反應體系中加入cDNA模板5μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTP(25mmol/L) 1.0μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，Taq DNA多聚酶0.25μL，H2O補足至25μL，反應條件為:94℃預變性4min;94℃ 40s;56℃退火35s;72℃延伸40s，35個循環;72℃繼續延伸10min。取等體積RT-PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并照像。

上游引物:5'-CGGAATTCATGAGACTCCACCGCCTC-3'，下游引物:5'-CGGGATCCCTTCTGAGCCATATCTGTG-3'。

1.5穩定轉基因細胞表達產物的功能驗證

收集細胞培養上清液，利用紙片擴散法檢測其對大腸桿菌的抑制效果。設置雙抗組(青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL)、細胞上清液組、無雙抗培養基組。

2 結果與分析

2.1 真核表達質粒pIRES2-EGFP-PBD-1的酶切鑒定

將構建的真核表達質粒用EcoR I和BamH I進行雙酶切，可以得到約5.3kbp和252bp片段(圖1)，與理論設計相符，再經PCR鑒定，仍擴增出252 bp片段(圖2)，進一步證實了陽性重組質粒。測序結果經Blast軟件比對分析，上述結果與NCBI公布序列(序列號NM_213838)100%一致(含信號肽序列)，表明構建載體成功。

2.2 真核表達質粒pIRES2-EGFP-PBD-1的PCR鑒定

利用PCR方法從提取的質粒中擴增PBD-1基因(引物見1.4)，電泳結果表明，擴增產物大小與預期的結果相符。測序結果表明，克隆的PBD-1基因含有該基因完整的編碼區序列，也包含信號肽序列(圖2)，可用于下一步轉染試驗。

2.3pIRES2-EGFP-PBD-1重組質粒穩定轉染marc-145細胞及表達產物功能驗證

pIRES2-EGFP-PBD-1重組質粒轉染marc-145細胞，通過單克隆培養，獲得4個100%具有綠色熒光表達的陽性細胞克隆株。至發稿時，轉基因細胞系均已傳代20次以上。在倒置熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光(圖3)。此外，上清液抑菌試驗表明，marc-145轉基因細胞系表達產物能夠顯著抑制大腸桿菌的生長(表1)。

3 討論

哺乳動物的防御素可以抗細菌、真菌、被膜病毒等多種微生物，尤其是對支原體、衣原體、螺旋體以及一些惡性細胞(腫瘤細胞)和艾滋病病毒有殺傷作用[9]，極有可能成為新一代抗菌藥物的理想選擇[10]。豬β-防御素作為防御素家族重要成員，具有極高的研究和開發應用價值。但豬體內天然β-防御素表達量低、分子小，分離困難，化學合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術重組表達外源基因已成為獲取目標蛋白的最有效途徑之一[3-7]。

本研究中采用的pIRES2-EGFP是一帶有增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)編碼基因的真核載體[11]。EGFP是一種優化的突變型綠色熒光蛋白，其產生的熒光較普通綠色熒光蛋白強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度，且熒光強度及穩定性強，目前得到廣泛應用。pIRES2-EGFP還含有CMV強啟動子和SV40 poly A加尾信號，前者可增強外源基因的表達，后者可增強mRNA的穩定性及轉錄效率。該載體還攜帶新霉素抗性基因，提供了G418篩選的標志，便于轉染細胞的穩定篩選。本研究將PBD-1 cDNA插入到表達熒光蛋白的pIRES2-EGFP的多克隆位點處，通過轉化、擴增和單酶切、雙酶切鑒定，成功的構建了含有PBD-1目的基因和熒光蛋白報告基因的質粒pIRES2-EGFP-PBD-1。它的應用可以使轉染細胞同時表達PBD-1和綠色熒光蛋白，所以它不僅能導入外源性PBD-1，而且可利用熒光蛋白的表達對轉染結果進行直觀、及時的觀察和檢測。

此外，經典途徑分泌的細胞因子其基因序列中都含有前導的信號肽序列，可引導蛋白質經由高爾基體-內質網途徑分泌。本研究中克隆的豬PBD-1包含起始密碼子、終止密碼子和信號肽。信號肽的存在保證了表達產物正常分泌到胞外。在此基礎上構建的豬PBD-1基因真核表達載體經酶切鑒定、序列分析完全正確，并在marc-145細胞上驗證了該載體的有效性，最終通過單克隆培養，獲得了4株穩定轉染PBD-1的細胞系，為進一步研究豬PBD-1的生物學特性及其在獸用生物制品上的應用奠定了基礎。

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