豬的繁殖調控技術(四)

中圖分類號:S828.3文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)04-0004-04

第六講豬的胚胎移植技術

豬的胚胎移植是指將一頭母豬的早期胚胎取出，移植到另一頭生理狀態相同的母豬生殖道內，使之發育成為新個體的技術，又稱之為“人工受胎”或“借腹懷胎”。提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體。一頭剛剛出生的母豬卵巢上有數以萬計的卵母細胞，但終其一生能發育成熟、排卵、受精并形成新個體的是極少數。如果應用胚胎移植并結合超數排卵技術，則可以使其繁殖的效率提高幾倍甚至幾十倍。如果說人工授精是提高良種公豬繁殖力的有效方法，那么胚胎移植則為提高良種母豬的繁殖力提供了新的技術途徑。

豬胚胎移植試驗成功最早于1951年由Kvashickii報道。到20世紀60年代，已經基本建立了外科手術方法采集和移植胚胎的技術。由于豬是多胎動物，繁殖力較高，用胚胎移植技術從少數優良個體獲得較多后代的要求不像牛羊那么迫切，因而一定程度上制約了胚胎移植技術在養豬生產中的應用。盡管如此，到70年代以后，北美和歐洲也開始將胚胎移植技術應用于向閉鎖豬群引進外血和國際間的引種。近年來，豬的胚胎移植技術日趨成熟，成功率大大提高，國內外已開始應用于良種豬和特殊品種豬的繁殖和育種。

豬胚胎移植的基本技術程序包括:供、受體的同步發情，供體的超數排卵和配種，胚胎的采集，胚胎的質量鑒定，胚胎的短期培養和胚胎的移植。如圖5所示。

有關同步發情和超數排卵技術，本講座的第一、二講已有詳細介紹。本講從“胚胎的采集”開始敘述。

1胚胎移植前的各項準備工作

1.1集卵管的制備

用于輸卵管沖卵的集卵管，長130～140mm、壁厚0.8～1.1mm、內徑3～4mm的玻璃管;用于子宮角沖卵的集卵管，外徑10mm、長130～140mm的玻璃管;兩種玻璃管均在酒精噴燈上中間彎成120°～140°角，兩端燒制、研磨平滑。

1.2揀卵管和移卵管的制備

揀卵管和移卵管相同，在酒精燈上拉制內徑為300～400μm的玻璃吸管，如圖6所示。

1.3表面皿的準備

準備直徑為8～10cm的表面皿，做為沖卵時接收沖卵液用。每個供體豬需備2～4個皿，寫好編號，放入培養箱待用。

1.4移植套管的制作

移植套管可用比移卵管前部略粗、外徑3mm、長約4cm的塑料細管，紫外燈下滅菌備用。

1.5手術器材的準備

將手術所需要的器材(手術刀、手術剪、止血鉗、持針鉗、巾鉗、縫合針、縫合線、創巾、沙布、表面皿、揀卵管、沖卵管等)高壓滅菌。臨手術時將金屬器械浸泡在0.1%新潔爾滅液中備用。

1.6沖卵液的配制

在試劑公司購置成品PBS或DPBS粉劑，按其說明書用雙蒸水配制。

1.7培養液的配制

短暫培養可以用沖卵液，但需加入10%的小牛血清。用0.22μm的濾膜過濾滅菌，然后分裝保存，待用。

1.8手術室的準備

豬場開展胚胎移植工作，人工受精的精液處理室即可代替手術室。每次手術之前，手術室需用福爾馬林熏蒸消毒。通氣之后，再用紫外燈照射。

2胚胎的采集

2.1采集的時間

根據采胚部位的不同，可分為輸卵管采胚和子宮角采胚。如果從輸卵管采胚，應在最后一次配種的48h內進行;如果從子宮角采胚，則應在最后一次配種的48～120h進行，同時應注意不同發育時間胚胎在子宮角所處的部位。供體豬采胚手術前應停食12h。

2.2供體豬的麻醉和保定

供體豬上腭牽拉，限制活動，將戊巴比妥鈉(2.5%)按20～30mg/kg體重或水合氯醛硫酸鎂注射液(水合氯醛8%，硫酸鎂5%)150～200mL耳靜脈注射，進行全身麻醉。由于個體之間對麻醉藥的敏感性不同，所以在注射時要隨時觀察豬的神態，注射的速度要慢，防止過量。一般在眼瞼剛剛失去反應，蹄部刺激無明顯反射時即可。

麻醉到位后仰放在手術保定架上，四肢固定。為防止手術過程中豬的掙扎、動彈，要用繩索將四肢和頭部捆綁牢靠。為使腹腔內臟向前傾斜，方便手術，手術臺要前低(頭低)后高(尾高)。手術過程根據需要肌肉或靜脈滴注適量的鹽酸氯胺酮。

2.3手術部位及其消毒

用肥皂水和毛刷洗刷術部，水洗后用毛巾揩干凈。手術部位一般選擇在倒數第2、3個乳頭之間，先用電剪或毛剪在術部剪毛，應剪凈毛茬，用清水洗凈術部，然后涂以2%～4%的碘酒，再用70%～75%的酒精棉脫碘。消毒程序是:碘酊棉球→酒精棉球，由內向外。蓋創巾于術部，使預定的切口暴露在創巾開口的中部。

2.4手術方法

沿腹中線，盡量避開血管，切開皮膚5～8cm，鈍性分離脂肪和肌肉層，使腹膜露出后，用鈍頭剪刀剪開腹膜。術者將食指及中指由切口伸入腹腔，在與骨盆腔交界的前后位置觸摸子宮或子宮角，摸到后用二指夾持，牽引至創口的表面。循一側子宮角導出輸卵管及卵巢，觀察卵巢表面排卵點和卵泡發育。

2.5輸卵管采胚

將集卵管一端由輸卵管傘部的喇叭口插入約1～2cm，用大拇指和食指固定，另一端接表面皿。用注射器吸取37℃的沖卵液15～20mL，在宮管結合部將針頭朝輸卵管方向插入，推注射器，沖卵液由宮管結合部流入輸卵管，經輸卵管流至表面皿。

再將另一側輸卵管引出切口之外，用同樣的方法沖胚。

2.6子宮角采胚

根據沖卵時間的不同，在距宮管接合部30～70cm的子宮角背面沒有血管的部位用眼科剪剪個小孔，插入子宮角集卵管，開口向宮管結合部方向，另一端開口接表面皿或平皿。用注射器從宮管結合部向子宮角注入30～50mL沖卵液。沖卵液流經子宮角，將胚胎帶入接卵的表面皿或平皿。鑒于子宮角過長，也可以采取分段沖卵的方法。

再將另一側子宮角引出切口之外，用同樣的方法沖胚。

2.7揀卵

將接卵的表面皿置于顯微鏡下，用低倍鏡的大視野在沖卵液中找到胚胎。豬胚胎直徑為150μm左右，肉眼觀察只有針尖大小，為一球形體，在鏡下呈圓形，其外層是透明帶。揀卵管先吸入少許PBS再吸入卵，依次在第二個表面皿內重復沖洗，然后把全部卵集中到一個表面皿，一只供體的卵放在一個皿內。操作室溫為20～25℃。

2.8供體的術后處理

供體采胚完畢后，用37℃滅菌生理鹽水濕潤子宮，沖去凝血塊，將器官復位。腹膜、肌肉縫合后，涂抹磺胺等消炎防腐藥。皮膚縫合后，在傷口周圍涂碘酒，肌注青、鏈霉素。

3胚胎的質量檢查及短期培養

3.1胚胎的質量檢查

在顯微鏡下觀察胚胎的形態、卵裂球大小與均勻度、色澤、細胞密度、與透明帶間隙以及細胞變性等情況。正常發育的胚胎，其卵裂球一般外形整齊清晰，大小一致，分布均勻而緊密，發育速度與胚胎日齡相一致。對發育正常的胚胎供移植或體外培養，淘汰未受精卵及發育異常的胚胎。不同發育階段的早期胚胎以及異常卵的形態見圖7、圖8。

3.2胚胎的短期培養

發育正常的胚胎如不馬上移植，可做短期培養。將胚胎放入用培養液制成的懸滴內，每個懸滴可放5～10枚胚胎;然后置于37℃、5% CO2培養箱中。這種方法可培養1～2d。如需較長時間的培養，則要更換培養基。

4胚胎移植

4.1移植的部位與數量

胚胎移植的手術過程與胚胎采集一樣。一般來講，如果不加培養，從輸卵管沖出的胚胎應移入受體的輸卵管內，從子宮角沖出的胚胎應移入受體的子宮角內。如果是經過培養的胚胎，或體外生產的胚胎，則要根據胚胎發育的階段，移入相應的部位。

由于豬是多胎動物，至少要移入4枚以上的胚胎，才能產生足夠的妊娠信號，使胚胎著床。一次移入15枚左右發育正常的胚胎，可以確保正常的受孕率的產仔數。而移入20枚以上的胚胎，既不會提高受孕率，也增加不了產仔數，反而浪費取之不易的胚胎。移入10枚以下的胚胎，受孕率和產仔數都將受到影響。

4.2吸卵的方法

移卵管吸取胚胎時要采用三段式，即氣泡—卵—氣泡，如圖9所示:

4.3輸卵管移植

受體按供體的手術方法麻醉保定后切口，將輸卵管和卵巢引出切口之外。先將移植套管從輸卵管傘口插入輸卵管至壺腹部，然后將吸有胚胎的移卵管插入套管，再將套管退出一部分，最后將移卵管內的胚胎和培養液吹入輸卵管內。移植完畢，小心將移卵管和套管退出，復原輸卵管傘。移卵之后的移卵管吸取PBS，置于顯微鏡下，檢查有無余卵。若發現有未移入卵，要重復上述步驟，移到另外一側輸卵管。確定管內無余卵后，即可將卵巢、輸卵管或子宮角清洗，送入腹腔，縫合術部，涂碘酊，腹腔注射抗生素。

由于豬著床前的早期胚胎，從輸卵管進入子宮角后是游動的，最后會基本按等距離排列著床于兩側的子宮角內，因此移入一側的輸卵管內即可。

4.4子宮角移植

手術使子宮角露出切口之外。把位于宮管接合部約5cm處的子宮角下方的子宮系膜用拇指和食指牢牢固定，避開血管，用鈍針垂直于表面刺入到子宮角內腔，制成小孔。再將預先吸有胚胎的移卵管從小孔插入子宮角腔內，將胚胎注入子宮腔內。

4.5受體母豬的管理

移植后的受體母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創口感染。同時，要單欄飼養，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產。受體母豬的營養水平，按懷孕母豬的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補充青飼料，做好觀察。

5豬胚胎移植的效率

豬胚胎移植的效率受操作人員技術熟練程度的影響?，F將湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所開展的豬胚胎移植情況介紹如下。

5.1胚胎采集的效率

從表8可見，輸卵管采胚的獲胚率接近100%，且明顯高于子宮角。

5.2胚胎移植的效率

從表9可見，輸卵管移植的受孕率和產仔數略低于子宮角移植，但兩者的差異不顯著;接近正常配種的水平。

5.3關于供體的重復利用

供體母豬只有能重復利用，才能使優良母豬的繁殖效率得到提高。供體母豬能否重復利用，一是取決于超排后激素的殘留及影響，二是取決于外科手術的影響。PMSG的半衰期為8～10d，HCG的半衰期為12～36h。董偉先生研究了PMSG在體內的存留期，測定的結果表明一般在10d左右。連續3次(間隔35d)注射PMSG，血液中未檢測出PMSG的抗體。因此，PMSG的適量使用，一般不影響下一個情期的正常發情。豬手術取卵切口較小，一般不超過10cm，只要按規定的程序處理，5～7d內即可完全愈合。筆者觀察了56頭湖北白豬青年母豬，在超排并手術取卵后，有52頭在17～20d發情，配種后正常受孕和產仔。

綜上可見，豬胚胎移植技術已經達到了實用的水平。

6胚胎移植技術在養豬生產中的應用

在以下幾方面，豬的胚胎移植技術具有推廣應用的價值。

6.1應用胚胎移植技術對優良母豬實施頻密產仔

以遺傳性能優良的母豬做供體，雜交母豬、地方母豬或其他不能留做種用的母豬為受體，實施頻密產仔。可采用兩種繁殖模式。

(1)一年產4胎的繁殖模式:保守的做法，可將胚胎移植與自然發情配種相結合，如圖10所示。這樣的繁殖模式可使優良母豬每年繁殖4胎，可增加產仔數16頭左右，提高優良母豬的繁殖力將近一倍。

(2)一年產9胎的繁殖模式:優良母豬只做供體，專事提供胚胎，每兩個情期超排、沖卵一次，全年可提供9窩胚胎，移植給9頭受體，獲其后代72頭左右，提高繁殖力3.0～3.5倍。

6.2特殊品種的快速擴繁

某些特殊品種豬，例如:香豬，版納豬，五指山豬，野豬等，普遍繁殖力很低，一般產仔數在4～6頭左右，應用胚胎移植技術可大大提高其繁殖力。以特殊品種豬做供體，其他品種或雜交豬做受體，可以大大加速特種豬的繁殖。

6.3地方豬的品種改良

目前，地方豬的品種改良，普遍采用引進良種公豬與地方母豬雜交的方式，得到的后代為雜種豬，不能做種用。如果采用胚胎移植的方式，以良種豬做供體，地方母豬做受體，得到的后代即為純種豬，從而大大加快改良的進程。

6.4豬的MOET育種

超數排卵與胚胎移植(MOET)是一項日趨成熟的胚胎工程技術，而且近年來對其在家畜育種中應用的研究與實踐不斷深入。通過MOET可使供體的繁殖后代增加2～5倍。據報道，應用MOET育種技術，動物生長性狀的年遺傳進展可比正常繁殖法提高70%～80%。

6.5用胚胎的運輸代替種豬的運輸

目前豬場引進種豬，不僅耗費昂貴的運輸費，運輸過程中種豬應激、減重、死亡也不可避免，更重要的危害還在于各種病原的傳播，給豬場帶來損失。用胚胎的運輸代替種豬的運輸，能有效地克服上述缺陷，不僅可以節省開支，而且可防止各種病原的傳播。

(全文完)