大白菜高效穩定遺傳轉化體系的建立

摘 要:以無菌苗下胚軸為外植體，建立了大白菜高效、穩定再生和遺傳轉化體系，獲得了轉基因抗性芽。結果表明，轉化效率最高的基因型為Seoul，最佳篩選培養基為MS+2 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA + 2 mg/L AgNO₃ + 300 mg/L Car + 10 mg/L Hyg，共培養基pH 5.2，完全黑暗培養，侵染液濃度OD₆₀₀=0.5，侵染時間為10 min，在此條件下轉化效果最好。GUS染色結果表明，GUS基因已整合到抗性芽細胞的染色體中，能夠穩定表達。

關鍵詞:大白菜;下胚軸;根癌農桿菌;再生;遺傳轉化體系

中圖分類號:S634.103.2文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2010)02-0001-07

大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)原產于中國，屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)蕓薹種(B.campestris L.)中的栽培亞種群，有許多變種和類型，在我國農業生產中占有重要的地位。蕓薹屬植物中，農桿菌介導的甘藍、小白菜、芥菜 、蕪菁等的遺傳轉化早已得到轉化植株。然而，具有AA基因組的大白菜與具有BB和CC基因組的其他蕓薹屬植物相比，外植體的離體再生能力最低[1]，使得大白菜的遺傳轉化研究進展緩慢。近年來國內外學者在大白菜組織培養方面取得了較大進展，已由大白菜腋芽[2]、真葉[3]、子葉[4~6]、下胚軸[5，6]、花藥及小孢子[7，8] 、花莖[9]等外植體得到了再生植株。但由于大白菜愈傷組織的植株再生頻率很低，遺傳轉化仍然很困難。在農桿菌介導的大白菜遺傳轉化中，下胚軸外植體的遺傳轉化效率顯著高于子葉外植體[10，11];而在有關大白菜不定芽再生的報道中，與子葉相比，下胚軸不定芽的再生頻率均很低，不利于大白菜高效遺傳轉化[12]。因此，對大白菜下胚軸外植體的再生做進一步的研究很有必要。本試驗以大白菜的下胚軸為外植體，研究了不同激素配比、不同基因型以及外植體苗齡、切段來源和接種方式等因素對不定芽再生的影響，建立以大白菜下胚軸為外植體的高效穩定再生遺傳轉化體系，為利用基因工程技術改良大白菜品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料無菌苗的培養

大白菜品種:陽春、強勢、Seoul和Olympic，均購自先正達種子公司。種子在70%乙醇中表面消毒1 min后用2%次氯酸鈉消毒 15 min，無菌水沖洗3次，然后接種于1/2MS固體培養基，于(25±1)℃、完全黑暗條件下培養成苗。

1.2 根癌農桿菌及其質粒

根癌農桿菌(Agrobactedum tumefaciens) 為LBA4404菌系。質粒PCAMBIA1301帶有修飾的GUS基因(帶內含子)和抗潮霉素B (Hyg)篩選基因。基因表達由啟動子CaMV 35S調控。

1.3 大白菜高效再生體系的建立

將黑暗條件下培養5 d的幼苗下胚軸(長約8～10 cm)切成長度為0.6～0.9 cm的均勻小段，接種于分化培養基中，培養20 d左右便可分化出不定芽。不定芽長到1.0～1.2 cm時，經切分轉入生根培養基中;待基部形成根系后，打開培養瓶口，于培養箱內煉苗1～2 d;而后取出小植株，洗凈根部培養基，再煉苗2～3 d，將其移入蛭石和基質混合的培養缽中;生長2～3周后，將植株移栽土中。

1.4 影響外植體再生的因素

在外植體再生影響因子的設計處理中，分別以某一因子為變量，以對應因子作對照，觀察各影響因子對再生頻率的影響，所有試驗處理均設3次重復。不定芽再生頻率用不定芽分化率來表示，不定芽分化率(%)=分化芽的外植體數/接種外植體總數×100。

1.4.1 不同基因型 4個不同基因型陽春、強勢、Seoul、Olympic分別接種于1/2MS固體培養基中，完全黑暗培養5 d后，將下胚軸切成適宜小段，平放在分化培養基中分化，3周左右統計不定芽分化率。

1.4.2 不同苗齡

以Seoul為試材，取苗齡3、5、7 d的無菌苗，分別切取0.6～0.9 cm下胚軸作外植體，平放在分化培養基中分化，3周左右統計再生頻率。

1.4.3 不同外植體切段及接種方式 以Seoul為試材，取苗齡5 d的無菌苗，切取0.6～0.9 cm下胚軸作外植體。分別取下胚軸外植體上、中、下切段按正插(形態學下端插入培養基)、反插(形態學上端插入培養基)和平放三種不同方式接種于分化培養基中進行培養，3周左右統計再生頻率，比較不同切段、不同接種方式的外植體不定芽再生的差異。

1.5 根癌農桿菌介導的大白菜遺傳轉化體系的建立

1.5.1 根癌農桿菌的活化及下胚軸侵染 進行轉化的前一天，挑取劃線培養的單菌落接種在YEB液體培養基中，于28℃、200 r/min振蕩培養過夜(16 h)。次日以2%的接種量轉接于50 ml不含抗生素的YEB液體培養基中繼續振蕩培養3～4 h，達到對數生長中期時，用MS₀液體培養基稀釋成不同濃度后，浸泡預培養3 d的大白菜下胚軸。之后取出下胚軸用無菌濾紙吸干，轉入共培養基中，于25℃條件下培養2 d，然后轉移到篩選培養基上篩選。

1.5.2 轉化體的篩選和植株再生 共培養結束后，轉入含有潮霉素(Hyg)的篩選培養基上進行抗性篩選和誘導芽分化，每兩周繼代一次。

1.5.3 影響農桿菌轉化效果的因素以Seoul為主要試材，在遺傳轉化各影響因子的設計處理中，分別以某一因子為變量，以對應因子作對照，其它因子以上述轉化程序為標準，觀察各因子對轉化效率的影響。所有試驗處理均設3次重復。轉化效率用抗性芽分化率來表示，抗性芽分化率(%)=再生抗性芽數/外植體總數×100。

①預培養天數:外植體在1/2MS培養基上完全暗培養5 d后，切成長約0.7～0.9 cm的小段，分別接種到預培養基中0、3、5 d，用OD₆₀₀值為0.6～0.8的菌液侵染5 min，共培養2 d，轉入選擇培養基培養。6～7周后，統計抗性芽分化率。

②共培養方式:外植體在預培養基上培養3 d后進行侵染轉化，侵染后分別置入pH 5.2、pH 5.8的共培養基中，觀察不同培養基對抗性芽分化率的影響。以pH 5.2的共培養基為準，又進行了光培養和暗培養2種方式對轉化率的影響試驗。

③菌液濃度和侵染時間:將預培養3 d的下胚軸，分別在OD₆₀₀值為0.3、0.5、0.8、1.0的菌液中侵染10 min，在OD₆₀₀值為0.5的菌液中侵染2、5、10、20 min，轉入共培養基培養2 d后接種到篩選培養基，6～7周后，統計抗性芽分化率。

④AgNO₃濃度:在預培養基、共培養基及篩選培養基中加入一定量的AgNO₃，濃度分別設為0、2、4、10 mg/L，觀察對抗性芽分化率的影響。

⑤激素濃度及組合: 影響外植體再生頻率的主要因素是培養基中的激素濃度。以Seoul為材料，設置了不同濃度配比的6-BA與NAA(見表10)，以篩選最佳的激素濃度及組合。

⑥潮霉素(Hyg)濃度:外植體共培養2 d后，分別轉接到Hyg濃度為5、10、15 mg/L的篩選培養基上，6～7周后統計抗性芽分化率。

⑦GUS組織化學染色法鑒定抗性芽:將轉化侵染后在篩選培養基中培養6～7周的抗性再生芽切下，37℃培養箱中GUS染液浸泡4 h左右，75%乙醇過夜脫色，進一步鑒定再生抗性芽。

1.6 統計分析用DPS軟件進行方差分析，并對平均數用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同基因型、苗齡外植體對再生頻率的影響

許多研究表明，植物離體形態發生能力與其基因型有著密切的關系，不同基因型的植物其外植體的不定芽再生能力有顯著差異[13～16]。Dietert[17]早在1982年就認識到基因型是限制大白菜不定芽再生的一個重要因素。將不同品種(雜交系)大白菜下胚軸接種于MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+2 mg/L AgNO₃培養基上進行培養，結果(表1)表明，不同基因型的不定芽再生頻率差異顯著。其中Seoul獲得再生不定芽的頻率最高(39.15%)，Olympic不定芽的再生頻率為23.26%;強勢只產生膨大愈傷組織，未長出不定芽;陽春偶爾會得到一個不定芽，但很容易玻璃化。Seoul愈傷組織和不定根較易產生，不定芽分化率較高，可見該品種在離體培養中細胞的生長、分化均較活躍，培養性能良好。

以Seoul為試材，研究了不同苗齡對再生頻率的影響，結果表明，3～5 d苗齡的大白菜下胚軸外植體再生能力無明顯差異(見表2)，以苗齡為5 d時不定芽的再生頻率最高，以后隨著苗齡的增加，不定芽再生頻率下降，苗齡為7 d時的不定芽再生頻率最低，這與朱麗華(2005)[18]的試驗結果一致。

2.2 下胚軸切段來源和接種方式對不定芽再生的影響

由表3可知，相同接種方式下，不同部位下胚軸的不定芽再生能力有很大差異。靠近生長點的上部切段再生能力較強，芽的再生頻率最高，其次為中部切段，下部切段再生能力較差。

接種方式對下胚軸不定芽分化也有顯著影響(表4)。相同部位的下胚軸切段，以不同方式接種到不定芽再生培養基上，都是先逐漸產生淺黃綠色疏松狀愈傷組織，一周后，愈傷組織迅速膨大并呈致密狀。此后，不同的接種方式表現出分化的差異，反插和正插的下胚軸接觸培養基的一端膨大得快，而且愈傷組織致密，芽點也較少，再生芽生長緩慢。平放的下胚軸一般兩端都有所膨大，但形態學下端較上端膨大得快而且大很多(圖1)。絕大多數平放的下胚軸在培養基上一般10 d左右出現芽點，3周左右分化成叢生芽，此時，愈傷呈白色透明狀(圖2)。

2.3 不同預培養天數對轉化效率的影響

在下胚軸感染根癌農桿菌之前預培養3 d，抗性芽的再生率為4.19%，不進行預培養，直接用根癌農桿菌侵染的抗性芽分化頻率為0.43%，預培養5 d后再感染根癌農桿菌的抗性芽分化頻率為1.80%(表5)。這表明預培養對下胚軸分化是必需的，但是時間過長，下胚軸活性降低，感染農桿菌后分化率降低。預培養可以減少傷害脅迫，調整細胞生理狀況，從而有利于根癌農桿菌的侵染，同時可以減輕經根癌農桿菌侵染后的腐爛褐化。

2.4 不同共培養基及共培養方式對轉化效率的影響

表6結果表明，pH 5.2和pH 5.8，以及光和黑暗共培養對轉化效率的影響差異不顯著，相比而言，黑暗條件和pH 5.2的共培養基更有利于抗性芽的分化。

2.5 菌液濃度和侵染時間對轉化效率的影響

菌液濃度和侵染時間對轉化效率的影響較大(表7、8)。菌液濃度過高或侵染時間過長，很容易導致外植體褐化死亡;菌液濃度過低或侵染時間過短，只會不斷地長愈傷，很難有抗性芽長出。從表7可知，當菌液濃度為OD₆₀₀=0.5時，抗性芽分化率為4.20%，當OD₆₀₀值為0.3、0.8、1.0時，抗性芽分化率都很低，尤其是在OD₆₀₀=1.0時，侵染后，農桿菌常過度生長以致抑制不住，嚴重毒害外植體。

從表8可知，侵染時間為10 min時，抗性芽分化率最高，侵染時間延長至20 min時，幾乎所有外植體在培養過程中褐化死亡或者被過度生長的農桿菌毒害死亡，很難獲得抗性芽。侵染時間為2 min和5 min時，抗性芽分化率也低。這表明，大白菜的下胚軸對農桿菌的濃度和侵染時間都很敏感。因此，適宜的根癌農桿菌侵染方法是成功轉化的重要條件。

2.6 AgNO₃濃度對轉化效率的影響

據Zhang 等[19]的報道，AgNO₃對遺傳轉化中大白菜外植體再生是必需的。杜虹等[20]研究表明，大白菜的抗性芽分化率從不添加AgNO₃的28.2%提高到添加后的71.7%，但隨著AgNO₃含量的增加，抗性芽分化率也有所降低。王火旭等[21]認為AgNO₃與ABA具有協同增效作用，其中AgNO₃是關鍵因子。本試驗結果(表9)也表明，添加不同濃度的AgNO₃對下胚軸的轉化效率影響明顯，并且能有效誘導不定芽的產生，其中濃度為2 mg/L時效果最佳。

2.7 激素濃度及組合對轉化效率的影響

6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)是誘導大白菜外植體分化不定芽最好的激素組合[22]。本試驗在MS培養基中加入不同濃度的6 - BA和NAA組合成6種培養基(見表10) ，將Seoul的下胚軸分別接種在不同的培養基上，5 d左右下胚軸兩端切口處開始膨大，侵染后一周左右長出愈傷并不斷膨大，4周左右有抗性芽分化出來。其中，2號培養基的抗性芽分化率明顯高于其它培養基，可見對下胚軸的誘導需要較低濃度的6-BA和較高濃度的NAA，這與誘導子葉不定芽的激素濃度及比值不同[23]。

2.8 潮霉素(Hyg)濃度對轉化效率的影響

適當濃度潮霉素對抗性芽的篩選很關鍵。Hyg濃度過高，對轉化細胞有很大的毒害作用，幾乎所有的外植體都會褐化死亡;Hyg濃度過低，對抗性芽不能進行嚴格篩選，容易產生假抗性芽。表11表明，Hyg濃度在10 mg/L時，抗性芽分化率最高，為4.46%;濃度為5 mg/L時，再生率雖然也較高，但大多是假陽性的，抗性芽分化率很低，只有1.24%;濃度為15 mg/L時，外植體只長愈傷，而且很快就褐化死亡。所以，本試驗表明在篩選培養基中添加濃度為10 mg/L的潮霉素，對大白菜抗性芽的篩選最有效。

2.9 抗性芽的GUS組織化學染色法鑒定

下胚軸經農桿菌侵染后，放到共培養基上培養2 d，進行GUS瞬時染色分析，下胚軸被染成藍色(圖3)，說明外源基因已經進入植物細胞體內并且表達。

下胚軸經農桿菌侵染后，共培養2 d，將外植體置于篩選培養基上培養，10天左右有抗性愈傷長出，3周后抗性愈傷上分化出抗性芽。取愈傷組織及芽染色后發現變成藍色(圖3、圖4)，說明GUS基因已經整合進細胞的染色體中，并且穩定表達。

3 結論與討論

建立高效穩定的組織培養再生體系是用農桿菌侵染植物細胞獲得轉基因植株的重要前提。本試驗在研究大白菜下胚軸高效遺傳轉化體系建立的過程中，發現不同基因型和苗齡的外植體、下胚軸切段來源和接種方式、不同預培養天數、不同共培養基及共培養方式、菌液濃度、激素配比、AgNO₃以及潮霉素的濃度都對其有不同程度的影響。本試驗中，最佳基因型是Seoul，以下胚軸為外植體，在預培養基中培養3天，最佳篩選培養基為MS+2 mg/L 6-BA+ 1 mg/L NAA+2 mg/L AgNO₃+300 mg/L Car+10 mg/L Hyg，共培養基pH 5.2，侵染液OD₆₀₀=0.5，侵染時間為10 min，完全黑暗條件下共培養2 d時，其轉化效率最高。

外植體的苗齡影響不定芽的再生，其機理可能是不同苗齡的外植體，細胞中基因表達的狀態不同，在離體條件下對外界因子的誘導反應不同。外植體苗齡越小分化能力越強，其機理可能是此時切面的薄壁細胞具有較高的再生能力，苗齡較高的外植體切面細胞已經開始分化，細胞分裂能力逐漸降低，故再生頻率較低。

以往研究表明，不同的共培養方式會影響大白菜的轉化效率，但本試驗結果表明，pH 5.2和pH 5.8以及光和黑暗條件下共培養對轉化效率的影響差異不顯著。這與楊廣東等[24]的結果有一定出入，可能與采用的外植體不同有關。

AgNO₃在組織培養中的作用很早就在很多植物上得到證實。Chi等[25]首先發現培養基中添加AgNO₃能顯著促進大白菜的子葉再生成芽。本試驗結果其濃度為2 mg/L時，轉化效果最佳。

本試驗結果表明，種子在完全黑暗條件下萌發5 d，預培養基中培養3 d，根癌農桿菌LBA4404侵染10 min后，完全黑暗條件下共培養2 d，轉到篩選培養基中進行篩選培養，結果， 10 d左右有抗性愈傷長出，3周后抗性愈傷上分化出抗性芽。但從抗性芽很難得到陽性植株，原因可能是:所用大白菜品種為一代雜交種，其分化能力差，陽性芽褐化嚴重，極易死亡。在今后的試驗中，還需要進一步摸索防褐化條件，減少抗性芽的死亡，以獲得轉基因植株。

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