LeJA2基因沉默表達載體導入番茄轉化系統的建立

摘 要:試驗設侵染時間、菌液濃度和侵染溫度3個因素， 利用根癌農桿菌將LeJA2基因按L₉(3₄) 正交表轉化番茄。結果表明，當菌液濃度為OD₂₆₀=0.6、侵染溫度40℃、侵染10 min時的轉化效果較好，從而建立了較優的LeJA2基因沉默表達載體導入番茄的轉化體系，并已得到14株轉化再生的番茄植株， 經卡那抗性篩選和PCR檢測，證明LeJA2-RNAi基因已導入番茄并表達。

關鍵詞:LeJA2基因;根癌農桿菌;番茄;轉化系統

中圖分類號:Q785 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)02-0016-04

目前，各類昆蟲的侵害對農作物生產構成了極大威脅，而化學殺蟲劑的使用對環境和人類健康都會產生極大的危害。因此明確植物自身的抗性反應機制，從而降低化學藥劑的使用量，成為目前的迫切需求和研究熱點。2003年，李傳友等[1]發現作物系統抗性中可以進行長距離運輸的是茉莉酸而不是系統素，因此茉莉酸介導的抗性反應途徑成為目前的研究熱點。LeJA2基因是番茄抗性反應途徑重要的上游調控基因，研究和明確該基因的功能對于研究茉莉酸抗性反應途徑具有重要的意義。本研究利用根癌農桿菌介導，將反義LeJA2基因導入番茄， 并試圖找到影響轉化頻率的主要因素， 建立起高效穩定的番茄轉化體系，為下一步進行更深入的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和培養基

1.1.1 菌株及基因 根癌農桿菌菌株LBA4404; LeJA2-RNAi基因，長度517 bp，位于載體pUCCERNAi上。

1.1.2 植物材料 番茄常規品種M82，由中國科學院番茄資源研究中心提供。

1.1.3 培養基 種子生長培養基:1/2 MS;預(共)培養培養基:MS+1.0 mg/L ZT;篩選分化培養基:MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana;生根培養基:MS+50 mg/L Amp+50 mg/L Kana+1 mg/L IBA。 上述培養基若加抗生素，均需將無菌的培養基置于超凈工作臺上， 待培養基冷卻至60℃后，再將無菌的抗生素加入。

1.2 質粒檢測方法

采用堿解法提取質粒，于含EB (溴化乙啶)的1.2% 瓊脂糖上100 V 電泳45 min，紫外燈下觀察，結果見圖1。

1.3 植物材料的準備取番茄常規品種M82， 挑選飽滿、粒大種子，用70% 酒精消毒2 min，無菌水沖洗3 遍;然后用10%NaClO浸泡15～20 min，再用無菌水沖洗3 遍， 接種于1/2 MS基本培養基上，于25℃光照培養。7～ 8 d 萌發后， 在無菌條件下切成子葉塊， 預培養1～2 d 后，即可用于轉化。

1.4 根癌農桿菌菌株及培養農桿菌菌液的制備:挑取一個單菌落接種于YEB液體培養基(附加50 mg/L Kana)中并于(27±1)℃、150 r/min震蕩培養。菌液以5 000 r/min離心10 min，棄上清，并用液體MS培養基重新稀釋懸浮后，以備轉化之用。菌液濃度以肉眼鑒別渾濁，對著光不透明為好(OD260=0.6)。

1.5 試驗設計

試驗設侵染溫度、侵染時間和菌液濃度3因素，因素及水平見表1，采用L9(34)正交設計。

1.6 外植體的轉化采用“葉盤法”[2～ 4]。切取無菌苗的子葉獲得無菌苗塊，在MS附加1.0 mg/L玉米素的D1培養基上預培養1 d，按正交表所提供的處理進行侵染，即分別浸入制備好的農桿菌菌液和液體MS

中，以浸入MS 中的子葉塊作為陰性對照。侵染結束后取出，用無菌濾紙吸干，然后接種于無抗生素的共培養培養基上(培養基上放濾紙)，在(27±1) ℃、有一定散射光的條件下共培養2 d 后，取出轉化塊和對照塊，用100 mg/ L Amp液漂洗10 min，進一步除去農桿菌污染，以無菌濾紙吸干子葉塊表面的液體，轉入 MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana的2Z培養基中進行抗性篩選(無濾紙)。轉入到抗性篩選培養基中的外植體，每2～3周繼代一次。2～3周后，對照葉片全部變黃或褐化死亡，轉化塊的許多外植體開始長出綠色或者白色的愈傷，也有部分外植體變褐或死亡。培養5～8周后產生抗性芽。當不定芽伸長至2～3 cm 時，用解剖刀將抗性芽切下，并轉接至MS +1 mg/L IBA+50 mg/L Kana+50 mg/L Amp的生根培養基上。

1.7 PCR 檢測

1.7.1 番茄總DNA 提取 取4～5葉齡的轉基因植株和對照植株的葉片， 按SDS 法提取總DNA。

1.7.2 引物設計 按照目的基因兩端序列，設計約20個堿基的2個引物:

LeJA2-RNAi-F(BamHⅠ):5'-GGATCCAAGACGAATTGGATTA-3';

LeJA2-RNAi-R(XbaⅠ) :5'-TCGTCTAGATTAATACTTTCAACC-3'

1.7.3 PCR 擴增 95℃變性5 min 后，加入2 U/μlTaq 酶1 μl，然后94℃ 50 s， 55℃ 90 s， 72℃ 2 min，35個循環;反應結束后，在含EB 的1%瓊脂糖凝膠上100 V 電泳30 min，紫外燈下觀察。

2 結果與分析

2.1 轉化頻率的方差分析

由表2可以看出，菌液濃度的R值最大，說明菌液濃度對抗性愈傷的出愈率影響最大;其次為侵染溫度和侵染時間。三者的最好組合為侵染濃度OD260=1.2，侵染溫度40℃，侵染時間10 min，此時轉化率最高，為15.13%。但實際試驗過程中，當選取農桿菌的侵染濃度為OD260=1.2時，羧芐霉素不能很好地抑制農桿菌的繁殖增生，外植體的邊緣受到農桿菌的毒害而發黑，從而死亡，這就大大降低了抗性愈傷的形成率和外植體的生長性，所以最終選擇菌液濃度為OD260=0.6。因此，如果要建立高效的遺傳轉化體系，就必須慎重選擇菌液的侵染濃度，同時選擇最適侵染時間和侵染溫度，以期獲得大量的轉基因植株。

2.2 PCR 檢測結果

選取30棵抗性苗進行PCR檢測，結果從14棵抗性苗中擴增出517 bp的目的帶，而未轉化的番茄植株沒有擴增出相應的條帶(圖2)。轉化過程中出現了一些假陽性植株，可能是由于番茄遺傳轉化體系建立過程中，沒有保證子葉外植體與培養基平整接觸，導致其因快速生長而出現上翹和卷曲，使農桿菌的接種面離開培養基，從而使一些非轉化細胞逃脫抗性篩選產生假陽性植株。

3 討論與結論

3.1 從原理上說，菌液濃度越大，侵染外植體的機率越大，轉化率越高;但當濃度過高，易造成污染，且很難除菌， 影響外植體的分化。本試驗結果表明，雖然正交試驗顯示菌液濃度為OD260=1.2時，轉化效率最高，但實際培養過程中，在此濃度時農桿菌大量繁殖，污染嚴重，許多外植體的邊緣發黑甚至死亡，所以最終選取菌液濃度為OD260=0.6。本試驗結果還表明，子葉外植體在菌液中浸泡的時間不能過長，一般10 min 左右即可，以防止培養過程中出現子葉外植體褐化或農桿菌過度生長，抑制分化成苗。所以最后選取的較優組合為菌液濃度OD260=0.6，侵染時間10 min，侵染溫度40℃。

3.2 在轉基因植株培養過程中，還會出現少數畸形化芽或玻璃化苗，主要表現為畸形化芽的葉片大、厚，無生長點;玻璃化植株葉片、莖呈半透明玻璃質，脆弱易碎，并且生根比較困難。這對提高轉化效率和轉化的穩定性都會造成一定影響 。

3.3 本試驗采用農桿菌介導法進行轉化，經過嚴格地 Kana 抗性篩選，淘汰了大量非轉化植株，并且成功地獲得了再生轉化植株，初步建立了番茄遺傳轉化體系。對轉化植株的 PCR檢測證明，LeJA2-RNAi基因已整合到番茄基因組中。

參 考 文 獻:

[1] 李常保.以番茄為模式研究植物對昆蟲抗性反應的分子基礎[D].泰安:山東農業大學，2006.

[2] 楊 健. 轉基因技術及其在西、甜瓜上的應用[J]. 中國西瓜甜瓜，1998 ，4:22-24.

[3] 傅榮昭，孫勇如. 植物遺傳轉化手冊[M]. 北京:中國科學技術出版社，1994，11，152-154，177-179.

[4] 王關林，方宏筠. 植物基因工程原理與技術[M]. 北京:科學出版社，1998，229-231.

[5] 余義勛，包滿珠. 反義ACO基因導入獲得瓶插壽命長的香石竹植株[J]. 園藝學報，2004，31(5):633-636

[6] 張智俊，羅淑萍，廖 康，等. 哈密瓜轉 ACC脫氨酶基因再生植株的獲得[J]. 上海農業學報，2002，18(2):10-14

[7] 王傲雪 ， 李景富 ， 徐香玲，等. 發根農桿菌介導的抗病毒基因導入番茄轉化系統的建立[J]. 東北農業大學學報，2000，31(3):233-240.

[8] 陳世勇.外源基因導入作物的分子育種研究進展[J].山東農業科學，1993，2:4-9.

[9] 黃 霄，楊秀梅，劉訓言，等. 轉正義基因番茄類囊體膜脂不飽和度對抗旱性的影響[J].山東農業科學，2008，3:37-42.